使用3 d-sim研究小鼠多瘤病毒的复制Sub-nuclear域

病毒已经进化出一个高度复杂和令人印象深刻的一系列与宿主细胞的相互作用。“劫持”的一种方式,病毒的宿主细胞,利用广泛的可用的细胞机制是通过利用细胞蛋白质和细胞信号通路中创建子域。这些子域作为细胞内微环境最大化生产的病毒感染宿主细胞的后代。

在最近的一项研究中“小鼠多瘤病毒DNA通过空间的转换不同的核在感染复制子域”发表在PLOS病原体,道格拉斯·彼得斯和罗伯特·加西亚的分子、细胞和发育生物学和博尔德的科罗拉多大学的BioFrontiers研究所调查了sub-nuclear域称为病毒复制中心(vrc)由多瘤病毒(MuPyV)。多瘤病毒是一组小的DNA病毒具有广泛的宿主范围,导致人类感染。这些病毒的复制以及其他DNA病毒,包括腺病毒、疱疹病毒和乳头状瘤病毒感染期间在这些复制区域形成。

胡MuPyV感染细胞治疗(羟基脲)用于调查组织(VRC)在病毒复制中心。C57BL / 6小鼠胚胎成纤维细胞(mef)细胞接受胡锦涛然后被允许恢复固定前4小时。Ch。1(绿色)是细胞复制的蛋白质(RPA32) Ch。2(白色)由鱼vDNA标记。Ch。3(红色)是病毒LT蛋白质。图片由道格拉斯·彼得斯加西亚实验室。

使用3 d-sim子域内提高分辨率

这项工作,共焦显微镜被广泛用于研究的许多方面病毒-宿主细胞相互作用。MuPyV病毒复制的存在中心已经使用这些技术。然而,它是不可能解决任何的细节vrc使用这种衍射有限的显微镜。这另一种成像技术是必需的。在这项研究中,彼得斯和加西亚使用3 d-sim调查vrc内的组织。SIM(结构化照明显微镜)提供了双重的增加分辨率荧光显微镜比较正常。这是通过结构化的照明模式之间的切换,与干扰形成莫尔条纹。傅里叶分析是应用于100 - 200纳米的合成数据和图像分辨率可以达到。3 d-sim,在这项研究中,使用的是一个SIM使用照明的发展序列,被安排在一系列的3 d空间格局在3 d允许更高的空间分辨率。

了解组织在vrc动力学

MuPyV基因组编码6个蛋白质。三种病毒蛋白质早期“肿瘤”表达,t抗原。大(LT)、中(MT)和小(ST) t抗原。这些与一系列的功能和相互作用在感染细胞蛋白质。细胞核内的LT发现蛋白质局部vrc,绑定病毒复制和起源解旋酶功能。宿主细胞的DNA复制的因素,比如复制蛋白(战)和DNA聚合酶δ,也被发现是本地化VRC,蛋白质和DNA损伤反应(ddr)。

在这项研究中,彼得斯和加西亚的报道,他们能够跟踪组件vrc如战,病毒LT和病毒DNA,观察他们的组织至少2单独的空间和功能不同的子域。一个“replication-associated”子域名明亮的LT和昏暗的RPA32所定义的信号。第二子域标识是一个“repair-associated”子域名与焦RPA32 pRPA32 pATM本地化和vDNA的积累。他们也能够观察到合成,与这些领域相关的病毒DNA顺序被细胞核内。

这些结果显示3 d-sim技术的好处相比,衍射显微技术有限。进一步的工作将帮助提供洞察的贩卖病毒基因组复制事件期间vrc -包括可能进一步子域内可能存在的其他步骤病毒周期如转录或病毒组装。

3 d-sim显微镜设置

3 d - SIM结构化照明照片被收购的尼康显微镜结构照明使用1.49 na 100 x油SR Apo TIRF 405/488/561/647提供的客观和照明激光线。一个和或iXon EMCCD相机是用作成像相机。的iXon EMCCD相机这种技术,因为它是一个理想的解决方案是必不可少的最敏感的探测器。EMCCD相机是最敏感的探测器的选择由于高量子效率的组合和EM放大,甚至提高单个光子检测水平很多时间在噪声背景之上。这提供了彻底的敏感性比sCMOS相机。使用较低的光照强度也可能是可能的,减少phototoxicty和漂白效果。原始图像数据获得随后处理和重建super-resolved 3 d-sim图像使用NIS-Elements 3 d-sim模块。

研究论文:https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008403

实验室:加西亚实验室,科罗拉多大学

加西亚实验室研究小DNA病毒的细胞生物学等多瘤病毒和乳头瘤病毒。这包括病毒装配中心的表征在细胞核,并定义的初始接触产生的促有丝分裂的信号与细胞表面神经节甘脂病毒衣壳。除了病毒感染的研究,实验室也在研究开发潜在的候选疫苗对人类乳头状瘤病毒(HPV)。

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MCDB——部门的分子、细胞和发育生物学在科罗拉多大学

BioFrontiers研究所科罗拉多大学的跨学科的研究机构

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选定的出版物

• Justyna Broniarczyk, Paola Massimi大卫·Pim玛蒂娜Bergant Marušič,迈克尔·p·迈尔斯罗伯特·l·加西亚,劳伦斯的银行。磷酸化的人类乳头瘤病毒16型L2有助于有效的病毒传染性条目。病毒学杂志》93年6月2019年,(13)e00128-19;DOI:1128 / JVI.00128-19
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