在延时显微漂移,漂移修正

显微镜受热力和机械漂移超过几分钟至几小时的时间。这主要影响焦点漂移,但也会影响XY坐标和阶段是各种内部和外部因素的结果。由于显微镜景深是客观的逆函数数值孔径(NA),这个问题是最严重的高分辨率的镜头,通常用于活细胞成像。

减少漂移的方法之一是仔细控制温度在实验室和允许显微镜延时实验开始之前达到热平衡。对高端机动倒置显微镜,制造商提供先进的闭环解决方案集中漂移校正(FDC),基于跟踪的反射光之间的接口盖玻片标本。在油浸镜头,反射出现由于oil-cover-glass折射率之间的差异和水支持缓冲区通常用于活细胞。然而,这增加了巨额的费用和不常见的直立显微镜。尽管一些第三方改造解决方案可用于立式显微镜,他们的表现往往是不可靠的情况下需要一系列不同的目标。当预算或配置使用FDC中排除,热稳定性结合软件校正可以用于三维成像方法。

实际考虑

在一个设计良好的温度控制和管理实验室都在±1摄氏度。当显微镜下达到热平衡在这样的环境下,在实践中我们发现,漂移是2 - 3微米的顺序在一个12小时的时间流逝的实验。如果温度不规范这些严格的标准漂移将显著增加超出这个水平。

在3 d延时补偿漂移收购,收购协议必须考虑漂移并确保重点抽样范围,超过的标本采样因子依赖于漂移两端的重点抽样范围。所以一个10µm堆栈在我们精心设计的场景”需要增加到至少12µm。这允许将焦点漂移校正漂移范围,用适当的软件算法。增加抽样样本带来的影响寿命和漂白标本暴露在超过20%的照明drift-free或FDC情况。然而,修正允许改进的量化和跟踪3 d细胞。

算法

软件算法校正,通常依赖于相邻时间点之间的相关性在3 d(体积)时间序列。潜在的假设是,样品将会改变时间点之间的相对缓慢,这高度相关的3 d卷将焦点偏移估计,可以应用到随后的体积。这个过程是通过时间序列重复成对。

在某些情况下,用户将种子盖玻片标本的荧光珠,作为基准(固定引用)特性。如果使用基准点,它们可以分割和跟踪。轨道位移可用于校正而不是整幅图像的相关性,这可能是一个沉重的计算负载。伊万里瓷器利用跟踪漂移校正的基准点,在跟踪模块是可用的。我们将在后面的部分说明其使用本文档。

一个创新,快速correlation-based算法称为Fast4DReg最近发表,可在ImageJ或斐济。(https://github.com/guijacquemet/Fast4DReg)。在这个算法相关匹配是利用,而是处理原始体元数据时,该算法使用最大强度投影3正交轴(某某)在二维相关性估计抵消在XYZ为每个卷组。这是非常有效的,一篇文章解释了算法及其应用今年早些时候在《细胞科学(J细胞Sci (2023) 136 (4): jcs260728)。自斐济(Bioformats)能够阅读本地融合/伊万里瓷器文件,可以使用Fast4DReg融合时间流逝数据非常方便。

说明工作流程1

伊万里瓷器与基准点
步骤1,在这种情况下我们有一个3 d时间序列只有基准点(500 nm珠子)绿色通道。伊万里瓷器10.0中打开该文件。

图1:加载3 d时间流逝和基准数据集。

图2:创建一个新的点对象并命名为基准点。点分割之前,确保“跟踪点”检查。轨道位移将用于正确的体元数据漂移。

图3:使用滑动条的质量和时间,确保在所有时间点选择珠子。对象是上面显示为灰色球体——注意时间滑块向右(对话框的底部)远指示后时间点。

图4:一旦通过向导可以创建可视化分段基准点和覆盖轨道或部分。

图5:选择4日从点左边的工具栏按钮(红色圆圈)显示正确的漂移选项。

图6:当基准点已确定和跟踪通过时间(跟踪),你就可以使用跟踪纠正图像中的漂移(体元)数据与各种选项所示的对话框。你应该包括图像正确的原始数据。

图7:您可以使用伊万里瓷器优势比较修正和矫正跟踪显示漂移校正前后。上面你会看到总漂移减少从2.5µmµm收购到0.5。

说明工作流程2

斐济和Fast4Dreg——不需要基准。
指的是Github页面访问Fast4Dreg插件和指令。非常清晰的指令。打开你的图片在斐济(Bioformats IMS可以直接读)。

图8:访问Fast4DReg Githib页,按照指示下载并安装代码。

图9:IMS数据集加载到斐济——这4 d数据集是伊万里瓷器工作流中使用相同的例子。

图10:4 d数据集,仅仅运行“时间估计+应用”脚本从插件菜单,以下对话框将显示。

图11:Fast4DReg对话框允许你设置批处理选项,使XY和Z的选择和定义各种设置,以加快这一进程或平均估计drfit多个框架等等。

图12:当处理开始,上述状态对话框显示和斐济工具栏显示进展通过数据集。

图13:当处理完成(根据数据大小几个许多分钟)结果保存在TIF格式,和XY和Z气管无名动脉瘘管的漂移块保存在文件图形。以上我们看到修正后的4 d数据集和估计Z漂移与时间。

结论

专注和横向漂移是常见的文物在间隔拍摄成像的活标本。尽管一些显微镜可选硬件漂移校正解决方案,这些可以为倒置显微镜和昂贵的只是不能用于直立的仪器。幸运的是,算法的解决方案可以应用注释的两种方法。第一种方法使用基准(通常是荧光珠)可以分段,随着时间的推移,然后用于跟踪修正体元数据的使用伊万里瓷器跟踪模块。第二种方法是基于一种快速相关技术,被称为Fast4Dreg在斐济免费或ImageJ。Fast4Dreg不需要基准但估计漂移时间点之间使用的相关性最大强度投影(MIPs)在X, Y和Z维度。这两种方法都有其优点和使用将取决于特定的用户需求和情况。