超分辨率显微镜并向所有人开放

快速、可靠和超分辨率live-cell兼容

科学物理定律强加的限制,限制的发现和知识的进步。在显微镜,到21世纪初,光的衍射极限是一个牢不可破的障碍。这条物理定律支配,两点不能得到解决(明显分离)如果他们靠近光的波长一半用来查看它们。在实践中,这将意味着,光学显微镜只能解决对象/结构,相距200海里或者更多。200海里的障碍会因此离开的知识发现了显著的差异,因为许多亚细胞结构和细胞器是小于200纳米。

在二十一世纪的第一个十年,光的衍射极限是克服使用一些巧妙的显微技术。一个新的发现是可以显示领域。几种方法对超分辨率进化,使成像超越光的衍射极限。超分辨率显微术等方法、(受激发射损耗显微术),风暴/棕榈(随机光学重建显微镜)/(单位面积荧光本地化显微镜)和SIM(结构化照明显微镜)已成为研究人员。

尽管发现的超分辨率方法开辟了一个新的领域,在这些方法存在一定的局限性。复杂的样品制备,长时间采集以及高能源需求采集,使这些技术不恰当的(如果不是不兼容)用于live-cell成像。此外,光学需求和计算机能力需要渲染这些老方法极其昂贵,无法进入许多实验室。

最近的进步与旋转磁盘共焦技术结合了光学over-sampling计算分配达到1.6 x改进超越衍射极限和适合live-cell成像,但是在重要的成本减少的视野,并从原始分辨率较低。此外,它仍然是高成本的硬件密不可分。

蜻蜓旋转磁盘共焦针孔大小和定制的独特组合针孔沥青分离有一个改进的轴向和横向分辨率,提供更好的解决常规成像。然后,使用光子重新分配(反褶积)获得图像,最终得到的轴向和横向分辨率蜻蜓可以分别240 nm和139 nm。

但如果研究人员需要更多的决议呢?或没有一个旋转的磁盘共焦显微镜吗?有另一种方法是快速、兼容住成像,这仍然可以获得super-resolved全视场和图片,如果需要,在内心深处的细胞?这些问题的答案是肯定的,与SRRF或SRRF-Stream +(图1)。

图1 -比较共焦成像,共焦成像和反褶积和共焦成像和SRRF-stream +。高放大倍数存在密切的ups为更好地可视化得到解决。双酚a细胞染色与phalloidin mitotracker和衣冠楚楚的形象与Ixon 888年共焦模式(没有SRRF)和共焦模式SRRF-stream +。

2016年,亨利克实验室开发了一种超分辨率方法命名SRRF——超分辨率(1)径向波动。SRRF可以结合宽视野,TIRF或共焦,最后决议将取决于获得数据集的礼节。使用SRRF算法,研究人员可以实现决议在XY 50海里(1)。此外,SRRF算法不需要特殊的样品制备或特殊的荧光团收购,兼容传统的荧光团和荧光蛋白。

最重要的是,一个super-resolved SRRF图像之间可以通过捕捉获得平均20 - 100帧(帧将导致改善分辨率)和所需的能量成像在兆瓦的顺序W /厘米²范围,使SRRF兼容live-cell成像。(1、2)SRRF最初是作为一个提供ImageJ插件。为了获得SRRF形象,长期收购工作流需要发生,SRRF-image收购后获得的处理图像中获得数据的J - NanoJ插件。

图2 - SRRF和SRRF-stream决议增加帧的数量获得每个时间点(加工)。)图呈现的决议增加越来越多的获得帧。它可以观察到有一个高增加到100帧。意思是礼物的平均径向波动相关性分析(在感兴趣的不同区域(ROI)。最小显示了对于一个给定的最大分辨率实现ROI。B1和B2)肌动蛋白丝成像和或使用TIRF蜻蜓(B1))和动态TIRF SRRF-stream处理(B2)。它可以观察到即使收购TIRF形态,SRRF-Stream提供显著增加分辨率。

2018年之间的协作和或和戴安娜教授,和或启动118bet.net金博宝app 。SRRF-Stream是安道尔´s SRRF算法的实现提供了超分辨率图像动态的点击一个按钮。与原SRRF算法,解决SRRF-Stream将改进的帧捕获每个给定的时间点。这是最引人注目的100帧,达到一个更稳定的增长从100帧到500帧,和一个非常温和的改善决议从500帧开始(图2,图3)。请注意,其他因素也会影响决议如曝光时间、奈奎斯特抽样,radiality放大和环半径增加;这些应该是为了优化测试结果。

图3——SRRF-stream分辨率增加的每个时间点的帧数。100海里tetraspeck珠子成像和测量应用。我们可以观察到,在100年收购了FMHW SRRF帧tertaspeck珠子是100海里。可以准确测量使用100 nm珠SRRF-stream算法和收购100帧。在共焦图像获取模式,并在共焦模式与不同SRRF-stream获得图像图像每点,分别是:100,200,500,700,1000。感谢安·惠勒博士,高级成像资源主管MRC遗传学和分子医学研究所的爱丁堡大学。

和或´s SRRF-Stream是一个重大的改进,允许live-cell超分辨率,深入细胞或组织的超分辨率方法超出盖玻片的顶部。

SRRF-Stream是可用的iXon生活和超EMCCD和sCMOS相机从Sona系列以及sCMOS ZL41。SRRF-stream可以通过微观管理者和融合控制软件是哪个蜻蜓共焦。SRRF-Stream的优点是(3、4):

• 允许实时超分辨率图像,增强工作流和避免后处理。
• 打破了光的衍射极限交付Super-Resolved最后的2到6倍增长分辨率的图像(50 - 150 nm),根据使用的成像模式(即宽视野、共焦或TIRF)和实验条件。
• 使用低励磁功率强度成像(mW - W /厘米²),这导致更高的兼容扩展活细胞观察和细胞生理学的影响最小。
• 与传统的荧光团和荧光蛋白兼容。
• 简单的样品制备。

SRRF-stream,因此,一个具有成本效益的解决方案显微镜,因为它们可以转化为超分辨率显微镜。SRRF-stream兼容任何成像模式,即宽视野、TIRF和共焦(图4)。

图4 -比较不同成像模式(宽视野和共焦)有无SRRF-Stream +MLKP1海拉细胞染色(红色),a-tubulin (green-microtubules)和DAPI (blue-DNA)形象的蜻蜓Ixon888相机。

2020年7月我们SRRF-Stream宣布额外的改进算法:SRRF-Stream⁺(图1、4、5、6、7)。

SRRF-Stream⁺更进一步增加radiality测量。SRRF的先前版本,radiality测量计算6方向和现在计算24的方向(图5)。这种增强将改善super-resolved处理数据的结果,和偶尔的明星文物以前可见,特别是在圆形结构如着丝粒,现在删除(图7)。

图5 - SRRF-Stream和SRRF-Stream Radiality计算测量⁺可以观察到的图像增加计算radiality SRRF的测量将提供一个更准确的结果图像。

得到最好的SRRF-Stream⁺之前,用户需要获取图像在奈奎斯特标准。之前报道,主要好处在决议将获得过采样的2.3倍或更高。不过,当过采样的1.5倍还可以取得良好的效果使用SRRF-Stream +。[1]

图6 - SRRF-Stream +交付高质量Super-resolved图像。双酚a细胞沾phalloidin(红色),mitotracker(绿色)和DAPI(蓝色)在共焦成像Ixon 888超模式(没有SRRF)和共焦模式SRRF-stream +

在分析数字1、4、5和7的好处SRRF-Stream⁺显而易见,但是一个问题将会为许多潜在用户的思维:影响收购的速度如何?如果SRRF-stream +计算radialities 24方向而不是6;是SRRF-Stream + 4 x低于SRRF的原始版本吗?在开发新的SRRF算法,和或考虑收购的速度也是一个至关重要的参数来许多研究人员。有可能达到改善图像质量的影响最小采集速度。为了达到这个目标,CUDA性能优化,完全利用的大规模计算能力加速的nVidia图形卡SRRF-Stream⁺计算。因此,100年延时时间点50SRRF-stream +图像每个时间点(对应于总共500张图片)只会随0.5秒在收购与原来的SRRF-stream进行比较[2]。

图7 -年代RRF流+提供高质量的数据。在非常高的放大,在特定的结构,这样的着丝粒一些明星产物可能偶尔出现。SRRF-Stream + radiality计算24方向消除了明星的文物。Cenp-A海拉细胞染色(green-Kinetochore)和DAPI (blue-DNA)成像在蜻蜓Ixon888超相机。

至于和或原始SRRF-Stream优势,他们在SRRF-Stream维护⁺但随着改善图像质量。超分辨率成像处理仍在超高速处理速率(快30倍)比ImageJ SRRF (“NanoJ-SRRF”),SRRF捕捉图像采集/处理,并行数据的采集。SRRF-Stream⁺算法将图像与最终解决和50 - 150 nm之间由于其低能量需求live-cell显微镜是一个理想的解决方案。超级解决图像可以获得使用大油田的观点,和重要的是超分辨率显微镜并不局限于细胞表面的事件。与SRRF-Stream^+,´s可能获得super-resolved形象深入细胞或组织,和不需要特殊的样品制备。

因为它是发射,SRRF-Stream已经成为广泛应用于许多应用程序。使用SRRF-Stream iXon相机的例子包括:分析线粒体贩运到细胞通过微管不稳定(5)终点站,或分析HIF1α间充质干细胞(6)的核易位。蜻蜓多通道共焦系统也被用来获得SRRF-Stream图片、例子:胞质分裂分析使用optogenetic工具(7)以及泡贩卖的影响研究分析二类pi3k的监管clathrin-dependent吞饮(8)SRRF-Stream的其他应用程序⁺包括蛋白质结构分析在sub-organelle层面,追踪细胞内的单分子膜融合的研究个人网罗蛋白质机械、细胞内骨架重新组装(肌动蛋白纤维网络的变化)。

总之,我们已经改善了SRRF-Stream兼容超分辨率算法提供live-cell甚至比以前更好的结果。SRRF-Stream⁺提供super-resolved胞内结构的图像没有文物,可以弥补相机固定图形噪声的影响,并交付高质量super-resolved图像。

很多其他应用程序和发现使用SRRF-Stream有待揭示⁺。你想知道更多关于SRRF-Steam吗⁺吗?与我们联系,我们将很高兴表现出来。

参考书目

1. Gustafsson, N。Culley, S。,Ashdown, G.等。快live-cell常规荧光团nanoscopy通过超分辨率与ImageJ径向波动。Nat Commun7,12471年(2016)。https://doi.org/10.1038/ncomms12471
2. Tosheva KL Culley年代,马托斯佩雷拉P,戴安娜R。SRRF:通用live-cell超分辨率显微镜。Int细胞生物101:74 - 79(2018)。https://doi: 10.1016 / j.biocel.2018.05.014
3. 布朗M。十二个原因你的下一个共焦应该蜻蜓。(2017)https://www.oxinst.com/assets/uploads/downloads/Dragonfly-Twelve-Reasons-Why.pdf
4. 科茨C,“SRRF-Stream”:实时超分辨率的相机。(2017)//www.awr-tech.com/assets/uploads/documents/srrf-stream-technical-note.pdf
5. 崔,通用电气公司,哦,J.Y.,李,H.J.et al。Glucocorticoid-mediated ER-mitochondria联系减少AMPA受体和线粒体贩运到细胞通过微管不稳定的终点站。细胞死亡说9,1137年(2018)。https://doi.org/10.1038/s41419 - 018 - 1172 - y
6. 李,H.J.,Jung, Y.H., Oh, J.Y.et al。BICD1介导HIF1α间充质干细胞在低氧适应的核易位。细胞死亡是不同的26,1716 - 1734(2019)。https://doi.org/10.1038/s41418 - 018 - 0241 - 1
7. Castillo-Badillo正当,Bandi a . C。,Harlalka, and Gautam N. SRRF-Stream Imaging of Optogenetically Controlled Furrow Formation Shows Localised and Coordinated Endocytosis and Exocytosis Mediating Membrane Remodeling.ACS合成器。医学杂志。9,902 - 919(2020)。https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00521
8. 昂,K.T.,Yoshioka, K., Aki, S.等。类二磷酸肌醇3-kinases PI3K-C2α和PI3K-C2β不同调节clathrin-dependent人类血管内皮细胞胞饮。杂志Sci69年,263 - 280(2019)。https://doi.org/10.1007/s12576 - 018 - 0644 - 2。

[1]更多详细信息如何样本iXon相机请去和或原创SRRF-stream科技报告。

[2]完整的视野(1024 X1024)图像与Ixon超了。