使用TIRF显微镜艾滋病毒衣壳脱壳动力学体外

病毒衣壳提供保护病毒基因组内,直到它可以交付到一个合适的宿主细胞的复制。一旦到达正确的位置在细胞内,衣壳结构分解迅速释放过程中的遗传物质被称为“脱壳”。除了作为防护结构,发现了HIV的病毒衣壳蛋白感染期间扮演重要角色如促进逆转录病毒RNA和其他功能的复制。这意味着病毒衣壳蛋白必须与宿主细胞的蛋白质和其他分子在不同细胞的位置和在不同的时间。尽管艾滋病毒获得重大研究多年,这种脱壳过程和主机辅助因子是什么仍不清楚。其中的一个原因是,在清除病毒,艾滋病毒衣壳分手很难获得完整的衣壳。

艾滋病毒衣壳本身是由单个病毒蛋白1000 - 1500份,CA。艾滋病病毒衣壳与衣壳多态一般圆锥形状的长度~ 120纳米。CA蛋白亚基可能hexameric或pentameric和结合各种异型的结构形式。因此许多衣壳不形式完全封闭的晶格结构,所以有缺陷。这种高度的多态性以及低组装富达方面相比,HIV病毒使研究更具挑战性更规范和统一的二十面体病毒。

实时可视化的艾滋病毒衣壳脱壳使用单分子分析

一个研究小组一直致力于改善我们的理解的脱壳艾滋病毒是新南威尔士大学的分子机器组、西德尼为首的烈性黑啤酒。一杯啤酒和他的同事们报告了单分子分析方法,允许个人艾滋病毒衣壳可视化实时——因此他们如何拆卸在他们的论文中,马尔克斯等:“HIV - 1衣壳脱壳透露由单分子动力学分析。在这项研究中,马尔克斯是烈性黑啤酒和他们的同事调查根据功能不同的衣壳类GFP释放动力学。这允许功能异质性的衣壳内人口被分类和相关装配状态。病毒膜permeabilized在一个受控的方式使用造孔剂在衣壳打开跟踪监控。这意味着不稳定的装配状态时可以观察到形成,否则不可能如果隔离衣壳散装生化方法。病毒膜透化作用和衣壳打开观察使用延时全内反射荧光显微镜(TIRF)监控GFP分子的释放被困在这些隔间。他们还使用了还有,宿主细胞蛋白质结合CA,有效地“油漆”CA晶格和研究晶格拆卸。

用描述的方法在这项研究中,可以揭示衣壳脱壳在hiv - 1和与宿主细胞相互作用capsid-binding分子细节。他们表明,hiv - 1的完整性和稳定人口的衣壳衣壳参差不齐。有趣,发现大多数的衣壳含有缺陷和/或裸病毒膜后立即删除。他们定义了两个离散脱壳事件:1。称为“衣壳打开”,另一个“晶格拆卸”和看代数余子式和药物的影响如PF74(一种抗艾滋病药物目标CA的艾滋病毒)在这些流程。这些研究有助于解决冲突的报道在以前的研究数据的影响PF74格子衣壳的稳定性。

从马尔克斯et al . (A) 复制的病毒DNA地图中包含向量pNL4.3-iGFP-ΔEnv。病毒颗粒与Gag-internal GFP标记作为解决方案阶段发布的(在成熟过程中蛋白质水解)是由HEK293T细胞转染pNL4.3-iGFP-ΔEnv和psPAX2摩尔比为1.4:1。(B) GFP-positive粒子释放HEK293T细胞转染突变体与野生型或PTAP图案pNL4.3-iGFP-ΔEnv psPAX2。TIRF (C)原理图的分析方法来衡量衣壳。(D)负染法TEM图像画廊的病毒粒子与成孔蛋白孵化卵圆孔未闭。卵圆孔未闭(E)分布孔隙直径(34.8 ± 5.2 nm,意味着 ±标准差,N = 347)。(F) TIRF固定化病毒颗粒的形象在450年 × 370像素的区域视野。 GFP (G)分布的强度为每个粒子领域的观点。

马尔克斯等人报告的方法提供了一种有效的手段来研究病毒衣壳与宿主细胞相互作用的方式。也可能是可能的这个更普遍适用于评估潜在的抗病毒药物的作用和有效性针对艾滋病病毒的衣壳和其它病毒性病原体。自出版以来,这项技术已经应用于许多其他的研究。

TIRF显微镜设置

对于这些研究自定义构建TIRF显微镜基于ASI-RAMM框架(应用科学仪器)尼康100×CFI高度消色透镜TIRF (1.49 NA)油浸的目标是使用。激光被注册使用NicoLase系统(Nicovich et al ., 2017)。图像捕捉到两个888年和或iXon EMCCD相机(和或技术有限公司)。管300毫米镜头是用来给视野88.68μmμm×88.68。第二个到光子学TIRF显微镜也使用蔡司100×计划高度消色透镜(1.46 NA)油浸物镜和固体激光激发。一个分束器允许同时使用两个双通道采集的荧光发射和或iXon 897超EMCCD相机检测的视野46μm×46μm。

研究论文:https://elifesciences.org/articles/34772

实验室:分子机器在悉尼新南威尔士大学的研究小组

分子机器直到烈性黑啤酒领导的研究小组专注于阐明分子机器的机制在细胞组装和拆卸过程中使用生物化学和生物物理方法的结合。特别是,他们开发荧光成像方法来可视化这些过程在单分子水平的动力。的研究领域包括:病毒脱壳,肌动蛋白细胞骨架的装配路径,即使伴娘的可视化流程和理解表面的特性和材料在分子水平上。工作利用从物理科学方法与微流控成像设备的发展,表面化学方法和开发的自动图像分析软188金宝搏能不能退款件。

了解更多:https://sms.unsw.edu.au/group/molecular-machines

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• 唐娜·l·Mallery K.M.里Faysal,亚历克斯·Kleinpeter米兰达南卡罗来纳州威尔逊,玛丽娜Vaysburd,亚当·j·弗莱彻Mariia Novikova,直到一杯啤酒,埃里克·o .释放,阿道夫•Saiardi,狮子座c·詹姆斯。细胞IP6水平限制艾滋病毒生产而不能有效的病毒包IP6减毒的感染和复制。细胞的报告。问题12卷29日,2019年,页3983 - 3996。e4, ISSN 2211 - 1247年。https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.11.050。
• 马尔克斯,c . L。刘,D。沃尔什,J。,里Faysal, K。帕克,m . W。Turville, s g和一杯啤酒,t (2019)。荧光显微镜分析方法来衡量hiv - 1衣壳脱壳动力学体外。Bio-protocol 9 (13): e3297。DOI: 10.21769 / BioProtoc.3297