现场测序和多路复用与蜻蜓高速共焦成像系统

挑战的背景

理解发展的分子基础,大脑功能,神经退行性疾病,癌症,和行为是一个巨大的任务。直到最近,rna可能是散装测序,或在单细胞水平,但不幸的是,组织环境信息被丢失。与smFISH (1)(单分子鱼),空间信息被保留,但这仅限于少数的基因可以可怕地分开。

收集2 d组织环境信息和(如果可能,3 d)是至关重要的建立网络构成组织的基因表达功能和疾病。现代细胞和分子生物学的圣杯,因此,探索基因表达网络建立与信息映射多个(Xⁿ在相同的示例)rna。

在细胞生物学是众多的检测多路复用(Xⁿ)rna(或其他生物分子)在一个组织/细胞,在其2 d或3 d上下文。多路复用成为神经科学的一个热门话题,oncobiology、疾病诊断目标,发展和行为研究。由于其在提供多个基因产物的空间和序列信息,应用程序的数量的新时代技术无疑将改变预计将继续迅速增加。重要的是要记住,这些技术可以出现在文献中很多名字:空间解决转录组,空间转录组、基因组学、空间和现场多路成像。

RNA生物学中,一些技术已经发展到允许现场多路复用。每一种都有其优点和缺点,但都有相同的目标,建立一个空间(视觉)基因表达的地图和连接它的细胞和组织上下文。这样的技术的例子instaSEQ FISSEQ (2), (3), osmFISH (4), STARmap (5), MERFISH(6)和seqFISH (7)。这些方法的相关性增长在科学界。它的重要性的一个例子是空间解决的转录组当选2020年度´s方法(通过自然方法)。

识别基因的表达在组织内,几轮杂交和检测需要执行顺序相同的样本。序贯疗法和图像并购执行使用微流体系统连接到显微镜。荧光探针标记杂交RNA分子,获得图像数据(通常是体积蒙太奇是扫描),和探针也冲走了。每个图像数据集被收购后,“地带和洗”一步是紧随其后的是另一个杂交。这个过程将重复N次,导致大量的图像数据进行编码。这样的一个数据集的一个例子是图1所示,从6轮实验和结果使用STARmap协议。每个在每个卷颜色和代表一个核苷酸编码的RNA序列。后,多路复用标签和数据采集步骤,离线分析管道用于将这些数据转化为所有基因的基因表达的地图针对一个特定的实验。¹

几个挑战需要克服实现适当的多路复用实验。基本技术主题包括自动化程序,采集速度、灵敏度和分辨率,光漂白,均匀性和吞吐量。一旦数据被收购,有几个被认为是生物信息学挑战。每个字段的数据或体积必须空间匹配,即使在变化和非线性形状变化,以便按顺序对核苷酸(ACUG)测序和明确分配给一个基因产物或信使rna分子。一致的和可靠的数据需求错误容忍或错误检查。

技术解决方案

基于成像多点共焦系统多路复用原位成像是一个很好的解决方案。任何这样的系统需要提供非常有效的背景以及高灵敏度和分辨率被拒绝提供准确的目标基因产物的本地化。由于实验过程的复杂性和预期持续时间,收购的速度是一个关键参数对高吞吐量和生产力。因此,同时获得多个波长的能力是一个理想的特性。

因为同样体积的样品必须在每一轮反复扫描或成像的过程,高稳定性也很重要。系统必须保持专注在许多轮的成像和连续的标签在流通池内的温度和条件发生重大变化。

温柔的成像采集系统应该优化,提供数据以最小的光漂白。为此使用的高灵敏度、高动态范围探测器是至关重要的,不仅允许低光收购,而且捕捉信号的全系列的样品。这些可能在几个数量级的变化,特别是当核DNA信号捕获作为这个过程的一部分。

当捕捉高分辨率卷扩展到毫米平方领域,深入到组织,理想的成像系统应该提供高度均匀照明使用的所有波长的整个视野。蒙太奇数据集获得高均匀性提供最好质量的输入数据来分析管道,结果是一致的信噪比在卷和帮助准确检测、识别和映射整个组织体积。

空间转录组可以几个小时每轮来执行,所以,6 - 10轮协议可以持续超过24小时。因此,至关重要的是,软件,硬件和微流体系统可以集成和同步的各种任务。理想情况下,这种集成应该允许灵活的和可定制的协议,可以调整实验的要求。

图1——鼠标海马STARmap序列标签,成像和蜻蜓。左图显示了一个字段的MIP蒙太奇的4通道和71 - z部分的深度20嗯;正确的MIP图像显示拼数据集。数据由阿巴斯Rizvi博士,哥伦比亚大学基因组学中心,纽约。

和或解决方案空间转录组研究

蜻蜓现场多路复用杂交是一个很好的解决方案。多点共焦,蜻蜓将交付高质量的高速共焦图像,(400 fps)在共焦模式。同样重要的是在组织扫描是大视场(FN 22),允许快速收购大量的组织。此外,双透镜磁盘系统结合和或´s高动态范围和高量化宽松相机等黑色背景Sona或iXon EMCCD系列允许捕获所有的信号样本:从最到最亮。

当获取数据多路复用原位实验,有一个实质性的一致性和高吞吐量的要求。使用和或´s专利北欧化工照明系统,蜻蜓提供优秀的全视场均匀性;此外,获得多个字段的视图以及成像不同波长同时,吞吐量大幅增加。

图2——框图Dragonfly-based与微流体系统现场测序(ISS)

最近注册的rest api内置融合软件,允许蜻蜓从外部控制程序例如Python,虚拟仪器,MatLab。这提供了沟通的能力与微流体系统顺序试剂流杂交,标签和洗,而蜻蜓成像硬件和管理可以触发需求获取空间一致,多通道体积数据。改变射流和成像协议因此容易控制的用户,一旦熟悉编程环境。这样一个系统的框图如图2所示。

蜻蜓的独特的高速度、高分辨率成像结合大视场,优秀的背景抑制和北欧化工照明系统提供了一个强大的工具来现场测序(转录组)。使用REST API扩展这些功能为研究人员提供了所需的工具来创建灵活的、+高度多路复用成像平台,

引用

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