学校和或显微镜- 9和10课超分辨率显微术是什么?

第九课成绩单

我叫西安Culley,我要给你超分辨率显微镜上两节课,很基础的技术,所以这种控制显微镜方法的整个家族都是关于什么。我个人目前本实验室的博士后研究员在伦敦大学学院分子细胞生物学。我一直在做超分辨率显微镜获得的十年现在,略有担忧,让我感觉很老了。

好的,所以这只是一个概述我们将要讨论在接下来的几个研讨会。所以我们要讨论决议的基本原则,它限制什么,为什么我们需要这个东西称为超分辨率显微镜。我们就会有一点点的深入探究三个主要的技术可用。发生的,这些是SIM和SMLM。我保证我们继续的缩略词都会变得清晰。

最后,我们要结束通过谈论字段在哪里,什么样的超分辨率显微技术与目前的挑战是,你可以看到在未来的几年里,超分辨率显微镜的前沿。所以,首先,我们先考虑大小尺度在细胞生物学。这里我假设大多数人的细胞生物学家的一些描述。我真的很喜欢这个动画,因为它显示了我们的各种我们感兴趣时细胞。所以,在最小的结束我们有病毒,一个数量级,然后我们有,例如,细菌。我们经过细菌,然后我们会另一个数量级,我们有真核细胞,我们开始变得更大、更复杂。

所以,如果我们做荧光显微镜,有很大范围的大小尺度实际上是有趣的。所以你可能会想看完整的细胞,但你可能想看看非常小的物体,如病毒或小结构在大细胞,例如,线粒体或其他细胞器。所以,首先,让我们想想实际上限制了最小的尺寸我们可以用荧光显微法解决的对象,我们的极限是什么?

的分辨率衍射极限,所以称为衍射极限。所以,我告诉你这是一束激光通过狭缝的照,你可以看到在底部,狭缝,这是激光的样子。现在,假设我们想尝试,让这个地方小,明显的,你要做的是把这个缝小,如此接近下来。我们希望使我们的激光点小的另一边。我们先看这个,看看会发生什么在中间这个地方我们关闭激光狭缝。所以它变小,然后令人震惊的事情发生了。和我们的现货实际上得到更广泛的传播出来,有点违反直觉的和意想不到的。

这是因为发生了什么是衍射。在左边,如果我们有一个平面波,所以,光是一波,我们有一个平面波的事件在一个相当大的缝隙,然后把平面波传播通过截断你的狭缝。然而,如果我们开始缝小,对波长的规模,我们实际上的波阵面时分散,所以它变成了一个圆形的波前,我们还没有一个平面波事件了。这发生在各种各样的波浪,将这样做。这是一个很好的例子发生在海上。所以这个视频显示,在这里我们有海浪,直波阵面。他们通过这个小的墙。正如你所看到的,他们在一个圆形的波阵面传播。这就是发生的光通过一个狭缝。但它只是更容易想象当一个可爱的海滩,我们可以想象我们而不是学习显微镜。

如果我们想到我们的显微镜,我们有这样的情况的。所以我们的光源,在这种情况下,它是一个荧光团,所以小GFP飞机发射波阵面。和狭缝本身实际上是我们的目标。这小光圈孔径的实际上是你的目标。是什么导致这衍射和传播通过显微镜的光。

我们把一个数字,最小的东西是什么,我们可以看到与荧光显微镜吗?我有一种我们的小的GFP在这里,我们想象很点状光源。绿色荧光蛋白分子本身,我认为,在5纳米的大小,这是非常,非常小,我们都知道。通过目标时,你得到的不是一个点光源5纳米的小,但你会得到一个叫做艾里斑模式,或430的点扩散函数。

这是通过圆孔衍射的干扰模式,就像我们的目标。你可以看到它有这个中央最大,然后小maxima出去向边缘。和这个中心最大的大小约为300纳米,好吗?但是这限制了什么?为什么这个300 -纳米?解释说,我们有我们的朋友在这里,欧内斯特·阿贝,他是一位德国的物理学家,一个优秀的胡子。和阿贝提出这个问题,他说,最小的可分解的两个物体之间的距离在你的显微镜,所以如果你有两件事相邻,多小你能看到,等于光的波长除以二,sinθ。sinθ,那究竟是什么?好吧,其实在你的目标,你客观的数值孔径。

所以,如果我们用一些数字,我们有600 -纳米光,所以红光,数值孔径为1.4,那么我们的分辨率是214纳米。好吧。这给了我们一种最小的数值表示的对象或最小的可分解的距离我们可以看到在我们的光学显微镜。为了给你们一个例子。我画的这是一个结构,您应该能够看到它的一对线接近在一起,一端有800 -纳米分离,在另一方面,他们10个纳米分离。如果这个物体成像与荧光显微镜有限的衍射,正如您所看到的,然后你得到这样的东西。

所以超过衍射极限,你仍然可以解决两种不同的线。但是当我们达到衍射极限,大约210 -纳米这个仿真,当这两个对象不再作为单独的事情,他们模糊成一个,好吗?这就是分辨率极限。它是最小的距离,你仍然可以发现有两个而不是一个对象,例如。你可以想象这是真的,真的有问题的,对吧?对于这个仿真,我们有上下文,我们说,“好吧,酷。好吧,我敢肯定这是某种形式的V形结构。”But if we didn't have the added context of our kind of low resolution structure that we could resolve, if we just had this, you have no idea what's within that blur, which is why resolution is a bit of a problem.

这是一种只是一个示意图不同大小尺度的细胞生物学。和我们想要的是我们想要的合适的成像技术为这些不同的对象。因此,荧光显微镜是伟大的,我爱它。非常好,因为我们可以看看生活结构,活的样本,我们可以看动态,我们可以得到我们的样品来表达荧光蛋白,我们有很大的调色板的标记工具,大量的优势荧光显微镜。当然,最大的缺点是它的分辨率,这正如你所看到的,我限制在约300纳米。

当然,我们也有电子显微镜。电子显微镜也受到衍射的限制。但它在这是波长的多,小得多。所以,使用可见光波长的数百纳米,在400到700纳米的范围内。电子显微镜使用电子束的方式,方法,更小的波长,方式小。当然,这就是为什么电子显微镜,尽管它仍然是有限的衍射,可以得到多,更高的分辨率。所以,粒子平均,他们几个埃在某些情况下。

现在,这种难以置信的决议的权衡电子显微镜,当然,你不能用你所有的标签,你不可能活样本,你有一个样本的经历了一个相当极端的样品制备过程。和你有你所有的可爱的荧光蛋白和染料和标记技术,在荧光显微镜。所以,超分辨率显微本质上存在填补这个缺口。我到之前,我们可以有一个快速的比较荧光和电子显微镜。因此,正如我所说的,荧光显微镜,你有很多的标签,这是live-cell兼容,和样品制备是很简单的,我们可以得到很好的,高时间分辨率和动态过程。但是电镜胜出时大量的空间分辨率。我们有一个,两个,三个数量级,也许,高分辨率电子显微镜。

好了,我要说的是,超分辨率基本上存在填补这个缺口。在这里,我们走。所以超分辨率技术基本上试图延长荧光显微镜的分辨能力你用电子显微镜所能达到的水平,或种的一部分。,重要的是,超分辨率显微技术希望保持与荧光显微镜的所有利益。这是试图让荧光显微镜方法电子显微镜的分辨率没有摆脱所有这些好处。如果我们现在看一下这个表,如果我们这个替换为超分辨率,我们还有大量的标签我们可以使用吗?是的。live-cell兼容吗?是的,但从理论上讲,这是我们会在接下来的几个会谈相当多。样品制备仍是很简单的。 And the temporal resolution can suffer a bit. And, of course, we'll talk about why this is. But you'll still get quite good temporal resolution in super-resolution microscopy, down to kind of seconds maybe, which is still pretty good.

当然,我们都寻找这是空间分辨率。和超分辨率技术现在可以让我们的决议20到150纳米,这取决于我们使用的技术。这是很好。我们没有到那种真正的纳米尺度的电子显微镜,但我们绝对比传统荧光显微镜。

希望从这个介绍部分,你应该满意为什么荧光显微镜的分辨率有限,它限制什么,和各种比较荧光显微镜和电子显微镜。好了,好了。我们现在进入超分辨率。有三个主要的超分辨率技术存在,有一个结构化的照明显微镜,或SIM,受激发射损耗显微术,STED还是和单分子定位显微镜,SMLM。有加载更多的缩略词,我们将遇到未来然而这需要很久。但这些都是你需要记住的真正的三巨头。

和他们的头脑中萌芽开始于90年代初。和他们真正起飞。我相信,2014年诺贝尔化学奖授予的一些先锋尤其是单分子定位显微镜,Stefan地狱,威廉·近代和埃里克Betzig。所以,这是所有说这些超分辨率显微技术是一个大问题。所以我们要穿过一个接一个,和谈论他们是如何工作的,有趣的是,我们可以使用它们的时候,什么样的条件的操作参数。

我们将开始与结构化照明显微镜。和我要的,不是警告你,但招收更多是的,承认这一事实,这是我个人努力理解。在我看来这是最直观的理解。所以不要担心如果它没有意义。我使用这种技术经常,我有时还坐在一起想,“我真的理解这个吗?”It's a bit of a brain tease, this one. But we'll do our best. And if it doesn't make sense, don't worry, I've provided some reviews and some other resources where you can go if you do want to kind of go over it a bit slower. Okay?

所以,之前在结构化照明显微镜,我只是想确保我们熟悉的频率概念的图像。我认为,这是一个形象Mitotracker在固定细胞。这是我们非常熟悉的形象作为显微镜工作者,这是我们在空间域结构。所以每个像素是一个物理距离。我们可以把每一个结构图像大小。表示完全相同的另一种方法在频域的信息。这对我来说是逆或互惠。我们通过一个叫做傅里叶变换。如果我们傅里叶变换的图像,如果你使用图像j,或斐济,例如,你可以做这个图片,它叫做FFT,快速傅里叶变换,如果你感兴趣。如果你这样做,我们在空间域的结构,然后你会得到这只长相怪异的情节。

这是代表相同的信息,但在频域中,好吗?在这个情节,当然,你可以回到你的原始结构进行逆傅里叶变换在看起来像这样。用傅里叶变换,你可以跳过后退和前进在空间域和频率域之间。这个情节告诉我们,从本质上讲,这是策划的不同的空间频率图像。所以更高频率对边缘和较低的频率是中间。所以较低频率的倒数距离或大小。所以,这个情节包含我们的大型结构的中心,和较小的结构,更多的细节,向边缘。然后超越这种中央环,这就是我们有高频噪音超出了我们的衍射极限。

就像我说的,我们有这个中心圈,所有我们的空间信息是包含。这是显微镜的截止频率或衍射极限。好吧?外的这个高频噪声,对在中间,低频率、各种大,脂肪结构,转向边缘,非常精致的细节。给你,我要做的就是我要带你看电影,我们仅从图像傅里叶域中的不同部分,只是为了让你满意,这是相同的信息。和我们的傅里叶变换的不同部分代表不同的大小结构在现实生活中。

这里我有我们的图像傅里叶,一开始我所做的我所做的是一个傅里叶反变换,另一个F是快。逆快速傅里叶变换的频率在这个循环。因此,在最高频率,6.51微米。如果我这样做,你可以看到,是的,的确,这是大的脂肪结构,这是低频信息。如果我玩这个电影,我所做的就是每次添加越来越多的频率。我添加这些频率,你应该看到的是什么,你会得到更多的细节在你的图片,好吗?所以我们走的更远的傅里叶空间,我们得到的更多细节在我们的形象。这不是SIM必然的一部分,这是任何荧光成像的基本属性,好吗?只是为了让你满意,图片和频率是一样的。他们只是互相的倒数。 Okay, great.

这与SIM什么呢?哦,好了,就玩一遍,为什么不呢?现在,我们知道要寻找什么。好吧。所以,这是我最喜欢的漫画,这是XKCD。不要担心的说,因为这是被记录,我不认为我需要这样的罪证。但是我们的小伙子说,“我拍了照片我的电脑屏幕上。为什么这张照片覆盖在这些奇怪的彩虹图案?”And the very smart woman in her armchair is saying, singing, "When a grid's misaligned with another behind, that's a moiré."

好吧。如果你不熟悉的漫画讲的是这两个人,就这样。这里我们有两个男人的照片在一种很疯狂(SP)的条纹衬衫,和一种波纹谷仓的门。你可以看到这些怪异的彩虹模式,这种奇怪的几乎像一个石油spill-type模式在这件衬衫和这谷仓的门。你没有看到他们在这谷仓图像的其他部分,例如。这些奇怪的糊涂什么脂肪模式,云纹干涉模式。这些波纹模式两种模式的结果是更高的频率干扰。

因此,每种情况的两种模式是什么?在这种情况下,我们的有条纹的图案的衬衫,这是一个高频模式。当我们拍照的时候,你还需要另一个模式,对吧?你得到的像素数组在相机。这是我们的第二个高频模式。所以衬衫条纹干扰的结构我们相机的像素网格的结构,得到这些低频云纹条纹,它们被称为,这个干涉图样。与这相同的谷仓的门。再次,我们有高频模式在这幅图像中,波纹的门,我们有另一个高频率模式,这是我们的像素和数组在我们的相机,我们的照片,以及我们其他的空间信息,我们之间也会干扰这两个高频模式云纹条纹。

这里有一件小视频的,再次,就表明云纹条纹在这些情况下是令人讨厌的。但你可以很巧妙地利用了他们找到更多的信息关于你的结构。这里我有两个高频模式。有某种结构里面,但你不能看到它是什么,直,另一只是一个网格,好吗?它只是网格线。你已经可以看到,我在重叠,可以看到云纹条纹,这低的频率信息。好吧。让我们看看会发生什么,如果我通过一个高频率模式。你可以看到,在这些云纹条纹,你实际上开始我们的一个高频信息的模式。在这种情况下,因为我是一个猫夫人,这是猫的照片。 And this is really cool.

所以你有我们未知的高频率模式,我们将一个已知的高频率模式,只是对条纹,我们突然得到所有这些有趣的信息干扰的两个。因此,低频波纹模式包含两个底层组件信息,好吗?这是非常重要的。这是两个频率的乘积空间干涉。所以在SIM究竟应该如何使用这个让我们解决吗?你要做的是,你认为好,模式。我有一个不为人知的高频率模式,我想询问。这是我的样本内荧光分子的分布。我怎么生成一些云纹条纹,能告诉我们更多吗?好吧,让我们照亮它与一个已知的高频率模式,例如,一个条纹照明领域。 So, instead of illuminating the flat field, we illuminate our sample with a striped field. And this results in a kind of image that looks like this, which are like, ugly, why would I do that? But this contains moiré information. This contains that interference information. And if you have a little look at the Fourier transform over here, you can see something we didn't see earlier, which are these little spots in the frequency space. And this is from the moiré interference, and this contains information about both patterns, on the kind of high-frequency level.

但重要的是,记住,我们不是检测之外的决议支持我们的显微镜。这带来了莫尔条纹在我们可解析字段中,好吗?,即使它的低频信息,它包含更高频率的信息在我们的样例。这是SIM收购是如何工作的。宽视野显微镜技术,你通过照明制造商通过某种模式,好吗?所以,这可能是一个衍射光栅,它可能是一个空间光调制器,你真的可以做的有趣的事情和这些干扰产生某种规律。基本上,你移动的阶段和旋转网格模式,采取一系列的图像结构。

所以,对于每一个旋转你的照明和相位,得到不同的波纹图案,你可以看到他们在傅里叶空间中旋转。这就是酷。我们如何使用它来增加我们的决议?现在我们已经有了所有这些波纹模式的干涉衍射的形象的东西更高的频率,和我们的网格。好了,我们能做的就是你可以想想这是像一连串的联立方程。和在现实中,在同一算法,这都是在频率空间,完成各种各样的模拟计算在频率空间,但你不需要担心,因为这是所有为你做的大部分时间。

因此,要理解它,我们要考虑这个在现实空间。让我们想象我们有我们的第一个莫尔条纹,我们知道这是我们的真实结构,我们不知道一个非常高分辨率与一个已知的卷积照明模式。好吧?所以我们有一个方程。所以照明模式。如果你缠绕结构,那么你得到你的莫尔条纹。所以你知道两件事在这个方程。然后,假设你旋转照明,你得到一个新的云纹干涉图样,而你,再一次,知道你的照明模式,和你的结构是一样的,好吗?所以,本质上,你这样做也许25图片,如果你把你所有的旋转和阶段。,本质上,你会得到一个很大的联立方程的矩阵,在你观察到云纹干涉图样与低频信息,你有一个高频率模式,你知道,现在你可以使用这种组合来计算你的实际结构和更高的分辨率比你之前。 Okay?

这样子如果我运行所有这些波纹图案,这些发光的网格模式通过重建算法,然后我们从有限衍射图像来重建我们的SIM卡在中间。视觉上,你可以看到,如果我们看看这两个图像开始,你会得到一个可爱的提高分辨率。例如,我们可以看一看这里的细节,你可以看到,我们开始看到这些线粒体的腔为例。如果我们看一看傅里叶变换,所以我们的频域图像SIM重建,可以看到,我们现在填满了更多的频率空间,对吧?这虚线圆与原来的分辨率限制我们的形象,这就是傅里叶变换衍射极限的图像信息生活。现在我们已经收到进一步的频率。所以我们达到进一步转化为更高的频率。和那些在我们作为更高分辨率的图像。

和我们的SIM卡圈,在这里,是我们的衍射极限圆半径的两倍。所以SIM决议翻了一番,这是非常酷。因此,回顾一下,SIM的关键特性是,这是一个广泛的技术领域,它与活细胞可以很好地工作。因为它并不真的关心你使用荧光分子。您可以使用荧光蛋白与SIM非常迅速。和网格模式并不需要太长的时间来旋转。所以它不需要大量的时间来创建这对SIM图像原始数据,这意味着你有一个很好的时间分辨率约一秒正常。

和彩色成像,例如,也很简单。再次,它不做任何奇怪的荧光。不做任何奇怪的类型的荧光团。这是做的一切都是产生干涉图样,然后重建,好吗?这是什么样的SIM卡的关键特性。只是一个快速浏览一些SIM显微镜的应用程序。有SIM显微镜可以从大量的商业制造商,例如,蔡司Elyra,和尼康N-SIM,通用电气/应用精度,我认为他们的名字,DeltaVision OMX。有很多SIM的商业解决方案,或者你也可以建立自己的如果你觉得非常大胆。但这只是一个SIM卡被如何使用的例子。

所以你可以SIM扩展到三维空间。我现在不会去讨论,为了时间,但它是可行的。这里是几个例子的三维和五颜六色的SIM已被用于观察核组织。所以,这是洛萨Schermelleh的集团。非常美丽的影像。你可以看到,他们所做的就是成像DAPI,染色的染色质,核板。你可以看到在共焦显微镜图像很酷。你可以看到一些染色质之间的核纤层蛋白类。如果我们然后去SIM卡,你看到更高的分辨率信息,你可以看到染色质小球之间的这些小管板形式。这是非常酷的。

最近的一个例子,这是3 d模拟成像显示一种DNA断裂修复蛋白质,形成壳破坏网站。这是我们的小休息一下网站的标志。这是DNA修复蛋白。和网站的保护免受损害而得到固定,确保突变得不到传播,等。3 d SIM常说,实际上,是的,这些都是蛋白质。这53 bp在三维空间形成一个实际的保护壳在这个微小的DNA破坏网站,这是非常酷的。

所以,就像我说的,可以使用SIM非常容易live-cell成像。在左边,我们有一个成像在t细胞免疫突触的例子。我们看到的是stabley免疫突触形成肌动蛋白与GFP标记的地方。这是SIM成像每800毫秒,所以非常快。你可以看到你可以看到例如,流和量化速度和方向的肌动蛋白在免疫突触。

在这里,这是很酷。这是SIM卡的硬件被用于体内成像树突棘。所以,你可以想象,这很有挑战性。但是,你可以看到区别deconvolved宽视野和仿真成像的荧光标记树突棘住鼠标,再一次,这是非常,非常酷。那么,SIM显微镜的局限性是什么?

好吧,一个大的限制是你只能相对于衍射极限分辨率的两倍。这样做的原因是因为这种模式,我们在照明也是衍射极限。如果我们能够形象超越衍射极限模式,我们可以进一步扩展该决议,但是我们不能,衍射总是限制我们。如果你通过所有的SIM马克斯,这有点痛苦,那你出来另一端说,好的,你可以在SIM最大分辨率的两倍。

现在,从理论上讲,你可以进一步与非线性模拟等技术,利用饱和荧光产生谐波,并且可以使用photoswitchable荧光蛋白,再一次,来获取更多的信息。但这并不是塑料SIM卡。当然,一旦你开始饱和荧光强度高,然后你开始失去活细胞成像的好处,例如。另一大限制或只是警告与SIM是重建,你把你的原始图像重建算法得到最终的图像,这些可以很容易的构件。这是一个很好的SIM重建从数据我们看左边。在右边,我故意做了一些重建参数不好,我做了糟糕的选择。

你可以看到它的形象做了可疑的东西你可能没有注意到如果你不是一个SIM卡用户,如定期。例如,这个线粒体结构,你可以看到在重建,它只是一种小管。而在我们平衡重建,同样结构突然看起来像两个薄,交织的结构。担心,你真的要很小心。这里是另一个例子。所以,如果你有不清晰的荧光,例如,SIM只是一种擅长很平坦的样品,不是厚的组织,和失焦荧光是一回事,真的可以毁掉你的一天的工件。

你可以看到在这个例子中,所有这些小格子工件出现在图像。所以,这是一种只要我们要与SIM卡。希望,你应该满意如果你消除与图案的样本信息和一代的云纹条纹,SIM卡如何使用的基础知识,提高分辨率,和一些SIM的主要优点和缺点,而这是一个棘手的问题让你的头部周围。这里的一些资源,可以帮助如果你想回去,坐下来,看数学和一些更深入的SIM是如何工作的。

好吧。所以下一个技术我们要讲的是受激发射损耗显微或发生。所以、是唯一的超分辨率共聚焦显微镜技术的主要三个SIM和SMLM都是宽视野,发生的是共焦。让我们有一个共焦显微镜的复习。在共焦显微镜,你有一个激光点扫描标签样本。假设这是一个模拟。我们说这是我们的标签样本,我们将有一个激发光束扫描在我们的区域,就会更快完成在这个仿真,但你懂的。

每次我们的光束通过一个标记模式样本,会发出荧光,你可以在这里看到。所以没有结构。作为我们的光束经过结构,我们得到一些发出荧光。这个发射荧光发生了什么?我们没有得到这个结构,我们刚刚得到的光子总数来自梁位置,进入我们的PMT。数量少,大量等等。这个数字被分配给每个梁位置即每个像素在你最后的编辑图像。太好了。希望这不是太令人震惊,那是好的和熟悉。

那么,影响了共焦显微镜的分辨率?现在,我们的扫描点,当然,有一个有限的直径,因为通过光学衍射。我们想回到那种缝我们显示视频,这就是发生在我们的显微镜,我们不能让我们的扫描点只是使我们缝小或小我们的目标。

所以,这对我们解决什么呢?嗯,例如,当我们的扫描电子束停在这个像素,即使没有任何荧光团在图像中的位置,梁的边缘实际上仍然是令人兴奋的分子很遥远。所以当我们看我们的形象,它没有零荧光,实际上有一个荧光值。所以我们的有限大小点意味着荧光团很长从现货中心兴奋,导致没有一个伟大的决议。

现在,我最喜欢做的事情之一在显微镜是假装我物理学的神。如果我物理学的神,我不打算摆脱衍射。我说,“如果我们只是让我们的小斑点,例如吗?”So, that's our limit, that's the physical limit, spot diameter from diffraction. Okay, back to the god of physics, i.e. me for the moment. What happens if I can just make that spot smaller? What does that look like? Well, of course, if you have a smaller spot, then, for the same position for that same pixel, spot is in the same place. But because it isn't as fat, you're not exciting fluorescent molecules a long way away, and you get nice higher resolution image.

好吧。是什么发生的,当然,我们不能仅仅使点小,衍射说不。是什么、它创建的影响小点用一些聪明的物理学的照片。、显微镜,我们有一个高斯形状的激发光束,在共焦显微镜,所以,强烈的在中间,很胖,调光器向外围。总是会想到发生了什么在这个位置,例如。是什么、它将在第二激光束的重叠与你共焦位置。形状像一个甜甜圈,如果我们称之为损耗梁。、梁,梁破坏,同样的事情,这是甜甜圈形状的梁。这是防止荧光在激烈的光束的一部分。好吧? So we're going to overlap these two beams, like this.

因此,荧光是阻止强烈地区的甜甜圈梁。在这束外围,我们仍然得到激发高斯形状激发光束在RA的位置。但随后发生的梁说,“不,没有荧光允许的。”So you don't actually get fluorescence in that part. Of course, the only pathway where fluorescence is allowed from is this dim center of the donut, i.e. the middle here, which looks a lot like a smaller spot that scans through your sample. So you only get photons detected from the central region of the scanning beam path as it moves through the sample. So it's kind of similar to having a smaller scanning spot.

所以,如何发生的呢?这是如何工作的呢?这是什么魔法,意味着你可以关掉你的荧光或抑制荧光吗?所以我们会有一个快速浏览照片的物理学基础。首先,我们要思考我们的甜甜圈中间发生了什么。所以我们激发光束是强烈的,但我们、梁是暗淡的。

那么,这些抽象的线条代表我们的荧光分子的能级。所以在这里我们有与小分子的基态sub-vibrational水平。这里我们有第一激发态的分子,再次,sub-vibrational水平。和分子是懒惰的,所以,在光束击中他们,他们会在这方面状态,能量最低的状态。所以我们激发光在甜甜圈的中心,分子吸收能量的提升为激发态。在很短的时间,你知道,我们说的皮秒或更短,得到振动弛豫。然后,过了一会儿,我们得到自发发射,或从这些振动水平较低荧光激发态回到基态。

和能量的释放,从高能过渡到低能量光子出来。这是你可以检测的荧光。然后你得到振动弛豫,我们准备另一个循环。所以,希望这不是陌生的。当然,如果我们考虑的光谱荧光分子,如果它是一个绿色激发分子激发,吸收峰,例如。然后我们会发现所有的红色荧光,这一切长波长荧光PMT使我们的形象。

好吧。这是同样的事情发生在正常在现货中心共焦荧光显微镜。好吧。在光束边缘呢?现在我们有激发光,我们有发生的光。好吧?所以我们现在、梁激烈。首先,它是完全相同的。所以我们的分子在基态吸收激发光,晋升为第一激发态。、光不与能级在这个阶段,对吧? But what it does is essentially sets up a standing wave between two energy levels. Normally, one of the lower vibrational levels at the first excited state, and one of the higher vibrational levels of the ground state. So it's not absorbed by the molecule, it's not doing anything kind of in terms of energy change at this stage, but it's there in the background, it's set up a standing wave in the background.

所以,我们的激发光被吸收,分子变得兴奋,我们的振动弛豫是标准。现在,这就是发生的光有它的效果,一旦我们得到这个阶段。、光基本上是一个能量转变的催化剂。好吧?所以,通常情况下,如果没有发生的光,荧光分子,这种分子,随机,回到基态。和它在随机波长。你知道,这就是为什么我们有一个广泛的光谱,它可以发生在许多不同的波长,它是一个随机过程。

、光存在时,真是种催化分子倒了一个特定的能量转换。能量转换、光子的能量完全匹配。这是一个过程被称为受激发射。我们基本上受激分子共鸣、光,好吗?、光不吸收,保持整个时间,对方中体现出来,所以你拿回你原来的甜甜圈光子。和它迫使你的分子回到基态的能量、光子。

当然,这意味着能源仍然需要释放。得到第二个光子从你的模拟任务看起来相同原始、光子。所以,激发进去,这是吸收。一旦光子,本质上是两个、光子出来。得到原始的光子,一个来自迫使你的荧光分子沿着这非常具体的过渡。然后再由振动弛豫。

唯一的主要差别是,荧光显微镜可以发生在任何…在任何旧的波长荧光发生。受激发射只发生在你、光束的波长。所以你可以过滤的很好。所以你仍然得到光,但你知道波长准确。所以,如果我们有一个光谱,你会有你的激发光激发峰,然后你的、光的发射光谱的尾巴。

所以你的荧光将C波段之间,然后过滤掉任何波长红比你发生的光,或在你的、光和超越,因为这将基本上甜甜圈回来了另一边。好的,很酷。

所以你唯一的荧光探测光的中心,并没有经历这发生的过程,受激发射。决定、显微镜的分辨率?洞的大小在甜甜圈的中心。因此,重要的是能够产生你的甜甜圈、显微镜的光学,他们仍然衍射有限,好吗?你不做任何打破衍射极限的方式你的甜甜圈。

你做的就是把这个洞在中间小仅仅增加你的激光强度的甜甜圈。这些戒指都是完全相同的大小,但我刚刚增加了强度。如果你想象一个高斯或一种钟形曲线,如果你增加强度,你也增加了,而且他的翅膀。这些翅膀侵犯到甜甜圈的中心,基本上。所以我们得到更高的强度,挤压小洞越来越小。你可以看到这个在这个小动画的纸,在24-nanometer直径荧光光束的成像。如果你没有发生,所以零发生的强度,然后你得到衍射到模糊。

如果你增加的强度、梁,你让你的甜甜圈洞越来越小,你增加你的决心,所以你可以看到所有这些个体小光束,真酷。

所以发生的关键特征是,它是一个共焦技术,它所有的共焦显微镜的好处。光学切片,你可以得到非常高的时间分辨率扫描一个很小的区域。它应该与任何荧光团的工作,只要你有正确的激发波长和损耗。荧光团都能够接受发生的,就像只是一个基本的受激发射光物理过程。具有讽刺意味的是,它实际上是一个激光做什么。缩写代表通过受激发射光放大激光的辐射。

所以任何可以接受受激发射,这不仅仅是一个荧光分子,什么会发生,如果你足够努力。空间分辨率技术上是无限的。所以,在理论上,你可以无限小,洞、梁无限强烈的通过。它不需要任何计算后处理的SIM卡那样,为例。所以,基本上,这是一种把、梁,让你的形象,它已经超分辨率。

和有一些商业的实现。所以,徕卡、显微镜,和伊比利亚航空仪器(SP)也不同、显微镜平台。很多、显微镜,在现实中,已经完成在国内建造系统。伊比利亚人的现在变得非常流行。但家庭建立的家酿、传统得到了迄今为止最好的决议。

让我们看一看、显微镜的应用。所以,这是一个例子的结构、显微镜的发现。这是这两种结构蛋白的双色、显微镜在果蝇的神经肌肉接点。在共焦图像,你可以看到我们的洋红色的蛋白质,这种蛋白质果蝇RIM-binding硝唑这个绿色的大团Bruchpilot蛋白质。如果我们发生的,你实际上看到的是它的周围形成一个环中央蛋白质。这实际上可以用于制作非常精美的三维模型,这种蛋白质分子结构的神经肌肉接点非常酷。

这里是一些双色住、显微镜的一个例子。这是一个非常细胞生物学的应用程序。这是看的蛋白,以及它是如何参与形成高尔基小管。再说一遍,我们的高尔基体是绿色的,r形式的蛋白质是红色。你可以看到漂亮的高分辨率,这是每10秒成像的结构。

特别是神经科学、也很受欢迎。当然,这就是因为我们爱我们的,你知道,我们真的很喜欢这些先进的共焦显微镜,我们可以穿透深入组织。实际上,这里有一个例子在体内发生的显微镜。这是在活老鼠。这是观察树突棘形态。所以,鼠标将表达某种荧光蛋白在这些树突。决议在这里你可以看到非常快,非常快的时间分辨率,事实上非常高的空间分辨率捕捉生活的动物树突棘形态学的变化,非常酷。

的局限性、显微镜,所以,你可以想象,彩色成像可以获得非常困难。记住,正常的共焦显微镜,你只需要一个激发光束/荧光团。、显微镜,你需要一个激发光束和损耗光束对于每一个荧光团,好吗?你不希望发生的事情,如果你不想让你的损耗束你的第一个荧光团开始激动人心的样本来自另一个荧光团的荧光。

虽然发生在技术上无限的分辨率,需要非常高的激光强度。所以,这只是一个小例子从纸质、显微镜的激光强度增加。这种不祥的黄色的东西是什么,这表明样本已经破裂,泄漏的样本的内容外,对样品造成物理伤害,因为你想增加分辨率,沉淀了大量的精力投入到样品。因此,可有点棘手。

我已经做了一些我的博士期间、显微镜从物理的角度,这里只是我所做的。所以,这些荧光晶体之一,这里是使用、成像。得到这些好的荧光晶体、漂亮的和结构化的形象。希望我的脸不是。在此屏幕上,但不是在我其他的屏幕上。道歉如果你不能看到,但是有一个融化晶体下面,我的脸是真的爆炸了,因为我在做、显微镜。

第一说话,所以,这是所有关于发生的希望。你应该熟悉为什么小光束意味着更高的分辨率。、如何使用光束整形和受激发射的光物理过程来提高分辨率,和、显微镜的优点和缺点。这是真的很好地看待本文。所以,谢谢你加入我上半年的这个演讲。我会看到你下次看单分子定位显微镜,和未来的超分辨率的途径。

10课成绩单

欢迎回来。这是第二个超级分辨率显微镜讲座,我给,这节课,……在课堂上我们已经覆盖了一个……我们讨论了衍射极限和SIM显微镜、显微镜和谈话,我们要覆盖单分子定位显微镜和更先进的技术,这个领域在哪里,什么是艺术,什么是先进的。所以单分子定位显微镜,也叫做SMLM……还有其他一些缩写词我会,,有点内解决。

所以首先,我们认为,单个荧光分子的形象是什么样子,好吗?这是一个真正的形象,一个真正的分子。这是一个形象,一个分子的Alexa萤石647,好吗?我拍摄的一个分子。酷。无聊,但很酷。所以我想让你看看图片,我想让你认为,我知道分子的中心在哪里以及如何自信的我对分子的中心在哪里吗?如果我看这我说,“好吧,我很确定分子的中心大约在这里。”You know, it's not going to be over here. It's not going to be over here. It's not even going to be here really, maybe here, but most likely here.

所以从这张图片我们已经可以推断出高分辨率信息比实际上是一个分子的形象。我们可以确定中心,精神比图像中我们可以看到,很多时候,如果你可以做一些精神上你可以计算。所以我能做的是适应二维高斯发现这个分子的中心非常准确。这是完全相同的信息,其中强度在z轴和X, Y是在这里,这是一个适合这个分子的强度。从适合的参数,我可以说,“好吧,酷。中心。”And I can relate that back to my original image to find the center. Okay.

如果我们有一个单分子的照片,我们可以相当准确地找出在高斯的中心是很容易适应,和这件高斯合身,质量如何,相信我们在合适的可以与我们的信心,中心在哪里。所以,你知道,这,代表我们定位的误差。所以如果我们可以符合高斯函数的图像单个分子,本质上我们可以获得中心和置信区间,中心在哪里。所以这样。所以它可以把我们的原始数据到更高的分辨率。太好了。

现在如果你想想一个宽视野荧光显微镜图像。例如,这是微管贴上Alexa萤石647年,所以,染料和之前我们看一样。这张图片是很多很多很多的单分子影像在彼此之上,好吗?这是一个图像包含了非常复杂的空间信息。我们在单分子定位显微镜寻找那些单分子。要做到这一点,而不是采取一个图像,我们所有的分子发出荧光同时,我们不是把一个非常大量的图像在一个非常小的荧光小分子释放出每一帧的数量。

所以我们从一个图像包含了非常复杂的空间信息的大量图像每个包含空间信息更简单,你可以看到这个样子…这叫做,眨眼,因为它确实看起来像闪烁。这样做,我们将讨论如何产生闪烁的,别担心,我们实际上得到的荧光分子开关。如果我们看这两个图像之间的差异,每一个个体闪烁的图像,我估计你甚至可以只是,你知道,如果你有纸和笔,就确定每个分子的中心,开始建立一个高分辨率的图像数据。所以我们不要用钢笔和纸,很明显。

我们用这个高斯拟合方法符合高斯函数在图像发现单分子然后我们渲染图像。这是图像建立的发现越来越多的分子。酷。你可以看到我有一个比之前更高的分辨率。所以,简单总结单分子定位显微镜,荧光在传播时间我们可以看到单分子然后我们可以准确定位每个单分子的中心和构建在示例的地图在哪里。太好了。

所以你可以想象,这整个技术的最重要的一个部分是我们如何真正实现闪烁吗?你知道,如果我们去显微镜,我们把我们的样品在我们刚刚获得长期的显微镜系列中,它不仅神奇地开始闪烁。要做到这一点,您需要能够有一个荧光标记系统的使用状态和断开的,好吗?所以我们的使用状态是荧光和发光,我们可以看到它。我们断开的是黑暗的,好吗?我们需要至少之间过渡向一个方向。还有这个,切换速率和在转换速率。所以决定多快你这些荧光各州和荧光之间的断开状态。和之间的区别很多单分子定位技术是如何生成的。

其中一个叫做棕榈,photoactivatable本地化显微镜,在棕榈你实现的闪烁用荧光蛋白光有黑暗状态和状态或某种形式的使用状态和断开状态之间的过渡。另一种方法是风暴,随机光学重建显微镜,在这种情况下,你没有荧光蛋白通路状态和断开状态。你有有机染料如Alexa萤石染料之间可以断开状态和使用状态。最后,流行方式实现DNA-PAINT闪烁,这是成像点积累在纳米尺度的地形,在这种情况下,它使用DNA的融化将short-labeled寡核苷酸样本越来越远,这就是你的使用状态和断开的,距离你的DNA分子的结构。

所以我要经历这些分别,只是得到一个他们喜欢的味道。所以我怎么实现闪烁在棕榈?这就是我们使用荧光蛋白质。第一个方法是使用photoactivatable诸如photoactivatable GFP荧光蛋白。所以photoactivatable GFP,破碎的GFP。如果标签photoactivatable GFP的样品,你有这个,,破发色团在中间你的荧光团,黑暗,好吗?如果我尝试和图像就像正常的绿色荧光蛋白,它不会得到任何荧光。这就是我断开状态。然而,如果我照一些紫外线,我激活光到一些GFP,所以照一些我的一些分子,他们随机接受这种重排的氢键激活发色团,好吗?

如果我运用紫外线激活我的一些绿色荧光蛋白分子就会变得活跃。所以他们会变成,功能性GFP可以兴奋,发出荧光。太好了。然后一段时间后可以回到黑暗的状态或永久使用状态可以漂白,所以我们可以有这些开关转换。所以你可以想象如果你成像,你有紫外线激活水平,不断地将荧光团的使用状态和激发你就得到相应的荧光,然后转换到断开状态。这个平衡的激活光和激发光让你眨眼率得到单个分子。

另一个类的荧光蛋白在棕榈photoswitchable荧光蛋白质,例如Dendra2。所以Dendra2,断开状态很糟糕的绿色荧光蛋白。所以如果Dendra2处于断开状态你试着用490纳米和图像激发,你会得到一些真正的糟糕的荧光,低强度的荧光。但另一件事,当你激发这种Dendra2断开状态,再次,它会导致改变发色团结构的中心。所以在这种情况下,碳碳双键的形成。然后Dendra2,照明与490纳米,可以把这个绿色的荧光团变成红色的荧光团,好吗?所以在这种情况下,如果我们还把561纳米等一些激励我们会得到大量的红色荧光。

棕榈,闪烁的是由激光强度和波长的紫外线photoactivatable蛋白质和激发光平衡那些得到正确的使用状态比断开状态和photoswitchable荧光蛋白将有必要转换光使它变成红色的状态与我们同时激发光产生的荧光检测。这是手掌是如何工作的。

风暴略有不同。这是使用类似的有机荧光团而不是荧光蛋白。风暴的使用状态基本上是相同的国家,我们使用所有常规荧光显微镜,我们有我们的激发和发射,我们只是打算绕过这个循环很多次,产生很多辐射,形象我们的结构。现在,这些并不是唯一的国家,一个荧光分子。这只是一个单重态的表征。还有一个国家叫的三重态分子,和技术,因为根据力学、单线态和三线态状态之间的转换是禁止的。这是一个量子力学,禁戒跃迁,但再一次,因为量子力学是古怪的,你可以打破法律。你可以如果你足够努力,打破禁戒跃迁。如果我们足够努力这是什么意思?

假设我们真的增加激励的强度。这个分子是什么意思?好,就将达到兴奋状态,它会发出荧光,然后它会立即回到激发态。所以当我们真的强烈激励的强度增加,我们最终支出方式不再我们的激发态分子比强度较低。如果你在兴奋状态,有一个小但可观的概率会陷入三重态,好吗?所以你不能去那里的基态。你只能去那里的兴奋状态。这是一个非常低的概率过程,你增加的概率本质上确保分子激发态尽可能多。

好的,我们进入三重态。酷。这将会发生,比如,随机,低概率,偶尔你会陷入在一个分子。如果你在三重态,你不能做荧光,所以你黑暗,好吗?这很好,对吧?我们有少量的对各种分子最后得到相当大的分子的断开的分子,因为我们不能做荧光三重态和三重态寿命要长得多比单重态。一旦它的三重态,虽然概率很低这一切发生的时候,保持很久,好吗?并可以秒,你知道的。一个荧光周期需要几毫秒。三重态寿命可以超过秒。 So that's how the blinking is generated in STORM. We knock our molecules into triplet state and from here they can undergo some more transitions. So within the triplet state, they can then go to a radical state and from that radical state, they can actually undergo permanent bleaching. You've broken your molecule.

或者,您可以试着带回分子通过化学为媒介的单重态和过渡,所以通常与缓冲。所以也可以调解,从三重态过渡到紫外线的单重态。所以,禁止单重态和三重态之间的转换技术但是你可以工程师情况实际上他们更可能比你指望他们,好吗?所以眨着风暴是由几件事情。首先,激励强度。这是推的东西到断开状态,我们的三重态,我们的缓冲,这是化学介导的转换可以把事情从断开的使用状态,所以荧光,任何紫外线,你把样品,因为还可以帮助恢复从断开的使用状态。再一次,如果你有正确的组合的激励强度,正确的缓冲条件,紫外线光照明,那么你可以很好地整合闪烁统计你的分子。

好吧。最后产生闪烁的方法是油漆,DNA-PAINT。所以DNA-PAINT…这是我们的断开状态。而不是标签我们的目标分子,我们要主要抗体的形象,说,有荧光染料结合或者是,你知道,荧光蛋白融合,我们做抗体标记的荧光团,而是,你把短链DNA链对接,好吗?这是一个单链的DNA。这就是我们标签样本除了可以看到没有标签。然后也放进你的样本成像仪DNA链。现在,这是我们对接的互补序列的DNA链荧光团。和我们的想法是你可以设计这些DNA链,这样你会得到随机绑定和解脱真的利用,,融化的DNA,将你的荧光分子,然后远离你的目标。

说它随机发生的,对吧?经常你的DNA链扩散,它会绑定到你的对接链然后开态发射荧光一段时间后,因为序列和DNA链的基本内容,将unmelt和扩散开,你得到这个开关,开关成像仪在你的DNA链,成像解决方案的交通你绑定和解脱感兴趣的目标。调解的事情所以你闪烁的概率,在这种情况下你的闪烁速率的序列DNA链和成像仪链的浓度。所以更高的频率越来越多成像仪链,就越有可能是,一个会来接近你的目标链绑定,让一个眨眼,基本上。

但基本上,如果你有算法,你不在乎它是如何生成的,好吗?如果你有一个过程的一部分,如果你……你知道,计算过程寻找单一分子,通常你漂亮的不可知论者是如何生成的。关键是,无论你如何让你的闪烁,在一天结束的时候,它总是看起来很相似。它总是看起来像小样本的闪光。所以无论如何你标签样本,它通常以完全相同的方式进行了分析。唯一一个真正的区别是你闪烁的密度。如果你有很多分子重叠,所以更多的向中央政权,事情可能会变得不同。如果你的算法不能精确地辨别一个分子或两个分子重叠,你开始的问题,但在理想的情况下,你会有好,稀疏的闪烁,很容易看到闪烁的然而生成单个荧光分子。

所以单分子定位显微镜的关键特性,这是一个宽视野显微镜技术和光学是非常简单的。对于SIM卡,我们需要投入一些光栅或模式发生器使高频模式然后线干扰。相反,您需要将在第二个激光与光学,甜甜圈。在单分子定位显微镜,你只需要一个宽视野显微镜高强度激光我们可以使用风暴和棕榈和确保我们调解这些正确的转换。和单分子定位的空间分辨率显微镜技术也是无限的。唯一限制你的决心是多么好你的健康是一个分子。再一次,你有无限光明眨眼,你可以适合真的,真的,真的准确,你会无限高分辨率。

所以单分子定位显微镜的应用是什么?这是最酷的事情之一被发现使用单分子定位显微镜和这是一种,细胞骨架子结构的神经元,这可以在三维空间中完成。我不会谈论你将如何在单分子定位图像三维显微镜,但这是可以做到的,我将提供一些评论,如果你想了解更多。但这是三维单分子定位显微镜,风暴在这种情况下。

所以我们看到的是,如果你做的风暴在各种细胞骨架组件如肌动蛋白、血影蛋白,adducin,你看到的是你真的看到这个美丽的条纹图案沿着轴突在这个周期的方式,并在不同的蛋白质,你看到他们,的设置,因为这很正常,可重复的间隔,沿着轴突形成的模式。从这个,他们可以让一个模型显示骨骼组织内的轴突。这些,肌动蛋白环约190纳米分离,所以他们无法与传统显微镜看到的,我认为这是,喜欢,一个很重要的角色比如钠离子通道的划分特定区域的轴突。这是很酷的。这就像一个最漂亮的在我看来超分辨率研究。这是一个真正的结构的发现。

最近,这是一个例子的风暴被用于发现病毒学的结构。这是牛痘病毒。这是一个非常非常大的病毒。约300纳米大小,但是,,分辨率的背景下,有问题的,对吧?和看到的是不同的…当你标签不同的膜蛋白在牛痘Alexa 647或风暴染料和图片,你可以看到,有一些类型的组织不同的病毒膜蛋白在病毒本身。例如,这些蛋白质偏振膜的技巧,这中扮演了一个相当重要的角色在其融合到宿主细胞的能力。所以,疯狂,结构上发现一个病毒膜使用的是风暴。

你能做的活细胞单分子定位显微镜,但这并不容易。这里有一个例子使用live-cell棕榈焦粘连。如果你做live-cell超分辨率几乎总是使用棕榈,因为荧光蛋白,除非你做一些在细胞表面,你可以使用一些表面受体抗体,等等。但是在这里你可以看到这些病灶粘连的细胞迁移使用live-cell棕榈。

所以单分子定位显微镜的局限性是什么?大的是你需要真正得到你的样品制备。你需要做的非常专业的荧光标签。你需要确保你正确地缓冲。如果您使用了错误的标签,它不会工作。有些荧光蛋白真的很难让他们眨眼。同时,您所使用的缓冲区和激光大国需要调解切换事件往往不是live-cell友好,和缓冲区通常是一个氧化还原缓冲所以他们控制氧化态。电池真的不喜欢它们。和激光大国又能很快非常强烈。收购还需要很长一段时间,对吧?

所以如果你想好了…你需要做的事情,如果你有很少的荧光分子发出荧光每帧,你真的大的帧数,对吧?你想确保你捕捉每个分子在示例至少一次。如果你不采取足够的帧然后你会得到不完整的结构。你不会真正捕捉来自每一个分子的闪烁的所以你需要真正低收购时间,不利于live-cell成像,当然,如果你已经使用激光强度很高,但也有点问题的动态结构。说你有一个样本的移动,你知道,你的荧光团的位置,,走之前你可以捕捉它,例如。

这里有一个这样的例子。这是来自相同的数据集的最后一张幻灯片显示,取决于你花了多长时间……你多少时间,分配给一个手掌图像可以改变的样子。这是焦粘连价值由30秒的成像。这是价值从180秒的样子的单帧影像。这不是一个时间序列,这是通过一个单一的框架,或者价值270秒的成像。他们显示在三个不同的颜色,青色,黄色,红色,你可以看到,你的结构是不同取决于有多少帧你获得单一的超分辨率帧,好吗?

最后,你可以得到当你想很坏工件定位的分子。再一次,我简要地提到的,例如,如果你的眨眼很密集,所以如果你不是很稀疏,如果你偶尔得到重叠的荧光团,可以重建有点乱了套。算法不知道如何处理这些重叠的分子的很多时间。想象你在这里已经有了一个分子一个分子,非常容易定位,这是两个独立的对象。如果他们重叠,那么该算法通常只是认为它是一个大的脂肪分子,实际上你失去信息,和这里有一个这样的例子。

这是一个很好的单分子重建的微管。你可以看到漂亮的,明确个人的细丝。在右边,相同的数据集,但不同的分析和分析以这样一种方式,它是一个真正的问题如果有重叠的分子,你可以看到你得到这模糊融合的结构。你得到不完整的结构等等。所以你可以得到一些很讨厌的工件在单分子定位显微镜。

制造商而言,所有主要的……所有主要的?尼康确实单分子定位显微镜。蔡司。有一个公司叫牛津Nanoimaging确实像很多桌面单分子定位显微镜,一次又一次,很容易找到在这种情况下,因为你不需要任何额外的光学。你只需要强大的激光。是的,这是单分子定位显微镜。

所以希望,之后,你现在舒服为什么我们可以准确地确定一个发射荧光团的中心。你知道,每次它们看起来总是相同的,这样你就可以准确地找出中心在哪里,如何以不同的方式产生闪烁,单分子定位显微镜的各种优点和缺点。这是我使用最在这里将有一个很好的审查,但也有一些幻灯片和一些示威活动我做了其他的分析,谈判,这可能是有用的,如果你想进一步看看这个。

这是主要的超分辨率技术。我认为你会希望……希望一件事,你会,实现从这两个对话是没有一个最好的技术,对吧?他们都有优点和缺点,例如,单分子定位显微镜有可靠的最高分辨率但可能最有可能杀死你的样品。SIM,另一方面,你知道的,它没有很好的空间分辨率但实际上非常简单。所以这是你想要什么样品?你想看到什么样的信息?和很多时间衍射有限公司是一个很好的路要走。

现在我,进入这些谈判说超分辨率是伟大的,它填补了这个,,荧光分辨率之间的差距和电子显微镜,但所有这些方法确实有相当强劲的缺点。如果你努力,得到显微镜在超级分辨率衍射极限政权不去,好吗?超分辨率只应做一次你优化和推动衍射极限政权尽可能把它。如果你想…从来没有进入一个成像问题就直超分辨率,因为你会让自己比你能解决更多的问题。

这里有两个很好的资源,比较不同的超分辨率方法,你可能会使用它们。本文在“自然细胞生物学”有这很好的海报其实,情节的优缺点和展示示例数据集。

好吧。那么此刻的超分辨率显微镜吗?SIM卡,发生,单分子定位显微镜,它们都是漂亮的建立。他们都被使用了很长一段时间。每个人都很熟悉他们。让我们回想过去的开始,,说话。为什么我们不做电子显微镜,对吧?,有非常高的分辨率。答案是超分辨率应与活细胞,对吧?你知道,否则我们不妨做电子显微镜。 So what I'm going to show you here is this is a fluorescent and transmitted light image of some cells that are expressing tubulin and GFP. You've got two interface cells that are nicely spread and two mitotic cells which are rounded up, and I've got the intensity of the laser illumination up the corner here.

现在,我要做什么在这部电影里,我要增加我们的激光照明的强度。我要看看会发生什么。所以增加了强度和很快就发生不好的事情。你可以看到这些有丝分裂细胞坏起泡。你可以看到这些界面细胞的收缩,你知道,当我们增加强度事情变得非常不利于我们的活细胞。和位置,强度这开始发生,不好的事情开始发生在我们的细胞比你想象的要低。尽管技术,如SIM,吹捧,你知道的……尤其是SIM卡。人们会说,“哦,它很轻,非常live-cell友好。”It's actually quite substantially into the regime where you start seeing these bad, kind of, phototoxicity artifacts. So once again, here is about where you use SIM and that's just when your cells look, kind of, starting to really show signs of utter distress. And this last frame here would be a typical STORM imaging intensity and you can see you just don't wanna be doing that with live cells, okay?

你知道,这些细胞不快乐的原因是光毒性,所以有很多事情会引起光的原因可以光毒性的细胞。如果您正在使用紫外光照,记得我们讨论的是单分子定位显微镜,你可以,你知道的……我们需要促进一些闪烁的转换。你可以诱导凋亡紫外线反应。你可以直接损伤DNA链,但最常见的原因为光毒性和超分辨率显微镜,在一般情况下,是可以产生活性氧,这只是一个biproduct兴奋很多荧光的东西你想形象和其他荧光体和分子样本。

每当你使用高强度照明,你生成活性氧然后围坐在细胞和细胞氧化一切,让你很不开心。好吧。所以氧化细胞是一个问题,对吗?我们想要做的活细胞超分辨率显微镜,因为你知道,如果我们不关心决议,我们使用普通荧光。如果我们不关心细胞活着,我们会用电子显微镜。

所以有不同的策略,我们可以使用它来解决光毒性和超分辨率显微镜。很明显,你可以试着与样品和提供更少的光。这是三个成像机制的一个例子。宽视野,我们照亮一切,共焦,你在一薄的光束照亮一切,只和双光子激发分子在焦平面。您可以使用非均匀照明,试图减少光剂量样本,例如,multi-focal照明,或提供你的光,的时间块。我们也可以做一些像空间自适应照明,根据荧光是什么在你的样本,你可以让你的,你知道的,光更强烈或没那么强烈,所以只有提供光激发分子的需要,例如。

你也可以使用光片照明政权。所以高斯光表,例如,你只照亮你的分子成像。再一次,如果你照亮平行于成像平面,然后好平面的光,你可以直接收集,或晶格光显微镜可以照亮一个很瘦面光所以你甚至不得到问题的启发性和令人兴奋的分子焦平面的上方和下方。

所以我们可以考虑空间自适应技术,这是已经做了很多、显微镜。牛津仪器,例如,现在有商业系统,可以做到这一点。说你有诸如救援、只是…在这种情况下,你用共焦扫描,激发激光,你才打开、梁有荧光。所以你不想实际交付、梁为样本没有荧光分子的地方。你只想把、梁和有强烈的分子,你有在你的样品。好吧。这是很酷的,采用激发激光扫描通过…哦,有荧光,将发生。扫描,哦,没有荧光,关掉发生。这样可以减少发生的光的量,进入一个示例。

DyMin和类似的技术,所以这实际上是调制的力量、横梁、所以、梁的强度,直到你达到某种分辨率阈值,例如,因为记住,假设我们扫描,我们就像,“好吧。我们发现一个分子,但是我们想尝试和提高分辨率这么多。”We've done it. Let's move on. So increasing the power of the STED beam until you've got just enough because resolution scales with beam intensity instead.

晶格光片显微镜,非常酷。这是一张晶格光显微镜的样子。它看起来不像一个显微镜,它可以照亮一个示例非常光薄片现在所示,然后检测垂直。这基本上可以结合其他宽视野的技术。所以你可以把这些表的光作为一个潜在的成像面SIM或单分子定位显微镜。这是很酷。少光交付不经历整个样本然后还做超级分辨率在这些薄片。这是一个晶格光片SIM的例子。这是肌动蛋白在活海拉细胞。所以你可以看到非常非常高的时间分辨率,,很好的空间分辨率。

在右边,我们将会看到使用晶格光表显微镜手掌的一个例子。所以在这种情况下,它是Dendra2 photoconvertible荧光蛋白我们前面谈到,从绿到红的共轭核纤层蛋白在核板,你可以看到建立的很好的高分辨率图像核板。再一次,你可以在三维空间中,光通过样品单,得到这绝对令人难以置信的美丽的三维解析。我只是想说,我看这一段时间,因为我认为这是绝对华丽。再一次,我们回来通过各种片相比,核的衍射极限。好吧。所以晶格光显微镜很酷。样本提供更少的光,因为你不真正照亮大脂肪块样本,瘦小的表,你可以做超分辨率成像在单个表的示例。

所以SIM有很多其他发展hardware-wise,这只是一个例子,因为我认为数据是如此美丽。这种技术称为掠入射SIM卡,再一次,正常的SIM卡,你会把你的光片放到你的样品但是你还是得到失焦荧光,你会得到,同样,光photodamage整个的列作为梁正在经历你的样品。掠入射SIM,允许你限制你的SIM成像焦平面一层平面。再一次,你可以有这一切真的漂亮,很快double-resolution多彩漆SIM成像,这绝对是美丽的形态。再一次,真的可爱的细胞动力学…,得益于这样一个事实,即你不损害你的样品,因为你没有输入光的整个厚度样品。你只是限制它有点地带。

很有趣的一件事是像素分配方法的出现,这些是诸如Airyscan iSIM,人们往往会说像素分配方法不超分辨率方法,因为你并不真正得到大量增加分辨率。你会得到可能增加1.4倍分辨率相比,分辨率,分辨率是2折,然后更高分辨率、和单分子定位显微镜。然而,这些都是目前非常受欢迎,因为它们不像photo-damaging光毒性的,而不是。他们也很容易使用,所以如果你考虑超分辨率技术用于成像,这些通常是一个很好的起点,因为他们可以开始告诉你,你知道的,少量的决议增加能做什么为你的成像。可能是足够的,它没有复杂的你的生活在某种程度上,一些其他的技术。这里有一个例子……我认为这是iSIM,你可以获得很好的动态在这幅图像中,见到你,,,真的可爱的评论在这里SIM的当前和未来的发展特别是包括大量的像素分配方法。再次播放电影。

最后,另一种方法解决在超分辨率显微光毒性…你知道,我已经向您展示了所有这些花哨的东西。自适应照明。有光片照明减少剂量的样品。但是如果我们只是把激光强度?可能发生的最糟糕的情况是什么?这是一个例子,Alexa萤石647会发生什么。这是一些真实的数据,有闪烁的数据,入射光强度约为每平方厘米2千瓦。的,比较,为基准,太阳在地球的照明……太阳的光照在地球表面约为0.1瓦特每平方厘米,这是一个高强度的情况。将此数据集是什么样子,同样的例子,同样的成像,如果我拒绝了激光强度?

这是超级分辨率渲染的数据集,它是这样的。这是40平方厘米的毫瓦,如您所料,它看起来像普通荧光成像。你不能看到闪烁。如果我试图做一些很愚蠢的,只是把这个数据集通过我的单分子定位算法,试图找到单个分子,然后,当然,我们会得到一个糟糕的形象。它不能找到任何看起来像单分子数据集。所以你可以做的一件事是有一个家庭,实际上,计算技术,试着从低强度数据得到计算超分辨率。

其中一个是一个是在我目前开发实验室,里卡多·恩里克的实验室,叫SRRF,超分辨率无线电波动,这是一个试图找到荧光分子的方法没有使用这个,二进制的……这是分子是的吗?这是分子不?的,这些概率说在哪里最有可能有分子形象吗?这里的图片,你可以看到我们回来好高分辨率图像没有丢失的所有信息在一个标准的单分子定位重建。

对SRRF的好处之一,例如,它可以用于任何荧光团或显微镜。这是一个例子,拉到GFP在共焦显微镜图像。SRRF使用10到100,正常情况下,每单帧SRRF图像分析系列的荧光图像,压缩成一个单分子定位算法一样但是没有试图找到单分子。再一次,你可以看到这是live-cell数据和细胞是很幸福的,我们有很好的时间分辨率高。再次,波动越大,强度变化越多,闪烁的越多,你会得到的高分辨率SRRF,但是,作为一个起点,你知道,这是一个很好的起点。你不会得到最高分辨率但你将开始看到你可能会去的地方不需要买一个新的显微镜或无需做一些非常奇特的样品制备。

和完成的软件发展的尖端超级分辨率,一件事,的涌现是基于深度学习的方法。这些使用的神经网络和强大,,artificial-intelligence-style计算推断出超级分辨率从可能不合格的数据集。这是一个神经网络技术的一个例子,使用神经网络重建SIM数据。这是数据与标准SIM重建和重建相同的数据,通过这个scU-Net重建。所以看起来很不错。看起来你有更大的分辨率。

还有其他类型的……再一次,这是一个非常增长领域。但另一个例子是ANNA-PALM,学习如何制作好超分辨率重建比你少帧通常投入重建一个分子。这是一个例子的宽视野的形象。如果您使用300帧,使手掌图像,那么它是这样的。如果你使用30000帧,使手掌图像,它看起来像这样。ANNA-PALM的件很酷的事情是,学习如何使图像看起来就像是获得了30000帧的数据,只有300帧。所以,这很酷。一句警告任何与深度学习是你从来都不知道这是做什么,好吗?所以你可以得到工件和没有意识到它们的存在。 Artifacts in super resolution microscopy, in general, they're present but you normally know why they're there. In deep learning, you're never really sure they're there or where they came from, so that's just a word of warning.

好吧。所以希望年底前,你现在适应光线如何破坏活细胞和如何使用硬件最小化在超分辨率成像光毒性。因此改变了我们也提供光与样品和我们如何使用软件来处理,像,不太好的数据和试着得到更多的分辨率的数据。和我们做了一个回顾最近在一个超级分辨率显微镜,光毒性,再次进入更多的细节。

只是总结一下,这是你应该记住如果你做基本上任何显微镜,不仅仅是一个图像包括任何类型的处理或任何类型的超分辨率。那么如何评估您的超分辨率数据实际上是告诉你什么?举个例子,在超分辨率图像强度是什么意思?的决议是你的形象,你如何衡量?然后你怎么能告诉如果你有工件在你的形象吗?所以是非常,非常,非常小心推断蛋白质数量或灰度信息,你知道,任何形式的绝对强度量化从超分辨率图像。

相反,SIM强度应该代表真正的分子数,但单分子定位显微镜强度可以真的误导。举个例子,假设我们有两个分子成像,我们形象的方式,仅仅通过纯粹的机会,我们的分子眨眼是我们的三倍左右的分子。如果你不正确地分析这些数据,如果你不欣赏一个单分子定位显微镜图像的强度意味着你可能得到一个这样的形象,你会说,“哦,有更多的蛋白质或有更多的荧光团左边比右边。”When in reality, that molecule just blinked more than the one on the right. So that's something you need to, kind of, just bear in mind and be really critical when you're looking at super resolution data. Think, you know, what's the author saying this tells us and is this actually what the information is telling us?

再一次,超分辨率显微术的大目标是提高分辨率尽可能高,但只是担心高分辨率并不一定等于高质量。这是一对传统和超分辨率图像在相同的结构。几年前,我做了一些软件。我还是开发一个版本2但这叫做松鼠。量化误差的方法在超分辨率显微镜,地图,这将给你一个错误,在这种情况下说的超分辨率图像相比,衍射极限的图像表现良好。你可以量化决议以各种不同的方式。一个流行的方式,这是里面的松鼠,是傅里叶环相关,但也有更新的技术,如图像解相关显微镜。

但在松鼠还可以做什么,例如,实际上是衡量图像的分辨率不同地区,它给你一个这样的地图。所以在松鼠,软件工具,可以用来评估你的图像的分辨率和质量。很酷,很好。有用的东西,我希望,因为它是一个无耻的把我自己的研究,但很小心你的思想,将高分辨率与高质量。在某些情况下,更高的分辨率成像是高质量的成像。我们看看在这方面,黄色的戒指。我们有很好的高分辨率成像。宽视野的等效,错误地图并不是说有什么特别的。但是如果我们看这个灰色的戒指,你知道,这是一个很好的解决,66纳米。这很类似于我们的决议在这个图像的一部分,但事实上,相比强度已经相当疯狂我们宽视野形象出现在错误地图。

再一次,这是更多的一种课关键的数据。如果你正在寻找一个超级分辨率纸和他们说,“哦,我们有30纳米的分辨率,”你知道,他们是如何测量分辨率?该决议告诉你什么?最重要的是,高分辨率并不意味着它是一个非常高质量的。它可以做但也不一定是一样的。好了,然后,,不过值得注意的是,非常感谢你听这些讲座。我希望他们很有趣和翔实的,如果不是,我希望至少有一些参考,你可以找到更多的信息我们已经讨论过的各种事情,祝你好运在你的显微镜。