学校和或显微镜,荧光光学显微镜原理

我是克劳迪娅Florindo、产品专家和或生命科学。188博金宝网页官网入口在今天的会议上,我将解释荧光是如何工作的,什么是做一个荧光显微镜实验所需的硬件和获取的图像,荧光显微镜的说明是什么,然后如何设置和设计自己的实验。让我们从头开始。荧光是什么?

荧光发射的光子被原子或分子的电子是暂时性的刺激到一个更高的能量状态,从地上能量到一个更高的能量水平。一旦他们回到基态,他们将发出光子,这是荧光。我们这里的表示一个原子和原子核和电子。一旦有外部辐射,电子去一个更高的能量状态,然后下降到低能量状态,他们会释放出光子。时释放的能量的电子回到地面总是比能量较低的能量来激发电子。出于这个原因,这个光子波长,对应的波长比入射波长的光。

所以,当入射光不复存在,荧光发射会自动停止存在。被称为荧光染料分子发出荧光。事实上,在显微镜,我们已经在荧光显微镜使用荧光染料的吸收和发射光谱特征非常好。因此,对于一个给定的荧光染料,我们知道它会吸收一定波长的光。所以,我们我们应该知道哪些光激发它,我们还知道什么是特定的荧光染料的发射波长,所以我们知道哪些我们应该用过滤器捕捉来自这个荧光染料的光。这些是给定荧光染料的最大吸收和发射峰。

斯托克斯位移之间的区别在纳米给定的荧光染料的吸收和发射峰。至于荧光染料,有几个特性会影响荧光染料,如化学环境的亮度,pH值、氧化还原电位、离子强度等,有几个功能极其重要的荧光染料。之一的量子效率,比光子吸收与发射光子的比值。这意味着最高的量子效率,更好的荧光染料,这给荧光染料在吸收光转换成所发出的光,所以光明。

淬火的阻力。淬火是一个过程,降低了样品的荧光强度。几个分子的相互作用会导致淬火等分子重组,基态能量转移和复杂的形成。如果荧光染料变成熄灭,他将减少很多发射的荧光和抵抗照片漂白。照片漂白的不可逆的损害是一个给定的荧光染料的荧光照射。所以照片漂白时,它会发出发出荧光,它将不再发出荧光。

这是常用的荧光染料在生命科学的概况。188博金宝网页官网入口我们有化学染料,如Alexa Hylite,花青染料。这样的例子在这里DAPI,吖啶橙,格林和俄勒冈州。和生物染料,其中大部分来自GFP,尽管目前还有其他生物生产这些荧光蛋白进化为我们提供一个彩虹色的调色板。荧光蛋白说话多一点,就像我刚才提到的,有一个调色板的颜色荧光蛋白可用于研究人员,他们可以使用这些荧光蛋白做多种颜色的实验。

他们中的大多数来自原始的GFP代表绿色荧光蛋白,但实际上他们中的一些人来自新蛋白质中发现的其他生物。但有更多比只是荧光蛋白,已经很多,照耀在所有彩虹的颜色。有照片可转换荧光蛋白。这些蛋白质开始辐射光在给定波长。但是,一旦兴奋,改变到另一个波长的发光。允许,在给定的实验中,专门跟踪一个超级的细胞在一个单一的时间点。

其他的例子是photoactivatable不发光的荧光蛋白任何光直到那一刻他们是辐照和激活。甚至photoswitchable荧光蛋白的蛋白质开始有一个发射波长等绿色。辐照后,改变其发射波长和变成红色,并进一步辐射,它将再次成为绿色。这些是几个例子的荧光蛋白质,可用于多个应用程序,比如CRISPR技术,optogenetic工具,等等。

现在,在硬件的EP荧光显微镜。我们开始与光源。有一个光源,发光的几个波长适合荧光显微镜。但是,我们需要一个过滤器多维数据集选择适当的波长。滤波器组的作品如何?它将有一个激励的障碍,二向色镜,和一个排放过滤器,激励障碍或激发过滤器。然后我们有目标,两种混合和探测器,可大多数时候是一个照相机。这里的一个例子和或相机。所以我们有光源。多波长的光源会发光,但我们只想与蓝光激发。

我们有一个激发过滤器,只选择合适的波长达到样品。它进入我们的目标,这是样品,并反射与另一个波长,波长更长,更少的精力充沛的光。的双色反射蓝光将允许通过绿灯,并且排放过滤器作为进一步障碍进一步选择我们想要获取的波长。光源,可用于荧光显微镜,我们有汞弧灯、氙弧灯、金属卤化物灯、led,目前在使用由于其较低的能量辐射。他们为荧光显微法非常有用。或者如果你使用多通道系统如蜻蜓可以使用集成激光引擎的ILE激光宽视野照明。

看起来有点进一步过滤数据集的内部。滤波器的主要组件立方体,正如我之前所解释的那样,激发过滤器,第一个障碍,选择所需的波长的光源,二向色镜,它将作为一面镜子,反映出所需的波长与样品然后将允许通过发射光激发过滤器和探测器。然后进一步激发过滤器作为障碍选择我们想要的目标的精确波长与特定的激励。解释一个更详细的图形和波长,是什么过滤集和它是如何工作的呢?

过滤器设置为我前面提到的,将再次强调允许样本与特定波长的激发,也将允许检测特定波长的激发后发出样品。在图形方面,我们有激发过滤器选择一定波长的通道。这里是二向色镜,反映了波长低于这条线。我们想象这将是400纳米,低于400纳米,但允许通过波长超过这些。这里排放过滤器,这将作为进一步障碍发射波长的选择。

总之,激发过滤器特别允许的激发光波长。二向色镜将直接激发波长光的示例并将专门允许发射波长光的通道,和排放过滤器将进一步stringe通道,…到达探测器的光。所以,不同类型的过滤器是根据不同的命名区分不同波长的能力。激发过滤器通常短传过滤器,因为他们允许通过更短的波长。排放过滤器通常长传球过滤器允许更长的波长和阻塞的通过更短的波长。和二向色过滤器或分割反映某些波长,同时允许其他波长的通道。

也有窄的带通滤波器,将阻止和更长的波长短,只允许通过波长的窄带。并利用不同的过滤器和二向色镜的特点,我们可以创建一组特定的过滤器集执行多色荧光成像实验来说是足够的。可以使用两种基本类型的过滤器,单个和多个滤色器集。单一荧光滤光片组将使更高的信噪比,但慢成像,而多色过滤集将使更快的成像,但较低的信噪比。

现在讨论显微镜的一个非常重要的部分,这是目标。有必要记住所有事情的显微镜。,例如,如果您计划使用DAPI和你有一个紫外线过滤器,过滤器,具体形象化DAPI和紫外线染料显微镜,在DAPI染色样本,然后你去显微镜,你无法看到。也许你的染色不工作。好吧?但也可能是另一回事。如果你的目标是无法发送紫外线染料,紫外线波长?如果是这样的话,你永远不会看到DAPI和目标。所以你需要注意硬件的使用和调整你的实验设置特定的硬件。

类型的目标是色盲患者,萤石和高度消色透镜,其中,但他们会提供不同类型的修正,这样,在成像的类型,它可以被交付。更高的NA将对应于更高的分辨率。NA意味着数值孔径,客观的能力来捕获更大角度的光线。我已经讨论了透明紫外线,但其他特征重要的客观表现,你应该知道当你思考的目标是低荧光玻璃制成的。

同样,如果他们能够提供透射光技术,你需要哪种类型的修正这些目标有萤石和高度消色透镜是一个计划,等意义,纠正对平场和如果他们纠正的彩色平面转变。目标在荧光显微镜也作为冷凝器。

现在我将谈谈相机。我将给一个简短的概述的相机。如果你想有更广泛的见解为显微镜相机和探测器,请参见前面的谈判这门课。所以,问题是,相机怎么样?摄像机在荧光显微镜彩色还是黑白?嗯,你这里有答案。在荧光显微镜,最常见的是黑白相机。但是我们有这些美丽的,多色图像。我们怎么能有这些美丽的、五彩缤纷的图片如果黑白摄像机?我们有这三个颜色的图片。 But in fact, what we do when we are acquiring is we acquire a micro tool grayscale image, a simple grayscale image, and the DNA grayscale image.

相机,然后,我将该软件将改变所有这些灰度图像映射到65000的灰色阴影,如果它是一个16位的相机,到65000年的绿色,红色的,蓝色的,颜色就会出现。还有我们有多色图像。为什么我们会这样做呢?我们为什么不立即获得相机的颜色?所以颜色相机,想象这是16-pixel彩色摄像头的芯片。通常,来匹配我们的眼睛颜色相机……所有的像素都掩盖了一个过滤器,滤色器,是绿色的,红色的,还是蓝色的。更好地满足我们的眼睛,如果这是一个16-pixel相机,从16个像素,其中一半,是绿色的,像在8日1/4是红色的,和1/4是蓝色的。这将在…辐射探测光从16像素的分辨率,我们只会…可以能够检测八在红、绿和四个分别用蓝色。 Therefore, we would have less resolution on a color camera than if all the pixels would be detected for each color individually. On the other hand, if I have a black and white camera, and I have the light source, it goes to the sample, it goes into the detector, all my pixels will be used to capture the green light, the blue light, and the red light. And therefore, I will have more resolution in a single image.

所以,警告在荧光显微镜。警告在荧光显微镜包括自体荧光,荧光滤光片组的渗滤效应可用,这是发出的荧光染料,是被绿色荧光滤光片组也可以立即被红色相邻过滤器集。这是红色和绿色的一个例子。但我的意思是,光线从荧光染料,应该被过滤设置,不仅捕获通过滤波器组,但也由相邻过滤器组b染料光褪色的不可逆损害荧光染料和lifecell光毒性。Lifecell光毒性正是其名,这意味着细胞死亡在实时成像实验中由于高能辐射对他们来说是有毒的。

自发荧光的原因包括内源性分子的自发荧光,使用一个过滤器设置不适合给定的实验,和反应所使用的固定剂。人们需要记住,记住,是理想的不同固定液会导致不同的自体荧光。一,我们需要选择最好的固定程序,2、适当的修复蛋白质,我们需要想象,而且如果可能减少自发荧光。和散射光的光学通路会导致自体荧光。

更多的谈论渗滤效应。渗滤效应是极其相关成像时多个荧光染料或荧光蛋白质自信号从一个特定的结构或蛋白质将被捕获在相邻过滤器设置,将面具信号来自蛋白质或结构。渗滤的原因包括非理想滤波器组带通的波长相当接近,而不是优化使用的荧光染料,也相关,非理想的荧光染料选择实验或显微镜设置。

可能的解决方案,减少曝光时间。如果你减少曝光时间最小化渗滤效应。使用高特定与很窄的带通滤波器组。但总是会有一些信号交叉所以请执行的控制实验,以确保你没有渗滤或你知道的数量的渗滤接触你会渗滤从一个到另一个频道。谈论染料光褪色。染料光褪色,正如我之前提到的,可逆的损害的荧光染料,和这里有一个例子染料光褪色的样本10激光扫描后几乎停止辐射任何光线,因此它几乎是看不见的探测器。所以,请注意,避免光漂白。

更多的染料光褪色。染料光褪色也,不出意料,在时间流逝显微镜极其重要。这里是一个例子,第一次的电影,电影的最后期限,你可以勉强看到的核沾染了组蛋白GFP。所以,更多的染料光褪色。它是由荧光染料的风险增加。这种接触会导致自由基的形成会导致修改的荧光染料分子,他们将因此少发出荧光。它将导致从一个三重态的单重态的转变。非常重要,光漂白是不可逆转的。所以,一旦我们漂白剂荧光团,它将不再发光。所以避免光漂白。 To avoid photobleaching, please use the most photostable dye possible.

减少样本的氧气。你怎么能这么做?您可以使用氮气和氧气拾荒者使用。在嵌入媒体使用防试剂。一点也不奇怪,减少曝光时间用来获得你的照片。然而,任何东西,如果用我们的优势,可以是一件好事。所以并不是所有的光漂白是不好的。有一个非常著名的技术,允许多个应用程序和研究分子的扩散的动力学,囊泡运输、运输沿着微管,叫收紧。收紧代表光漂白后荧光恢复。这个技术允许可视化多快一个特定区域的细胞恢复荧光细胞一旦辐照有这么多光所有的荧光染料漂白。

这允许确定分子的扩散系数从一个地区到另一区域的细胞。这里是收紧的一个例子使用和或镶嵌在这些特定区域是漂白的。你可以看到他们变黑。然后你可以从其他地方看到的分子扩散的细胞成黑色的区域。在移动,在荧光显微镜的警告,我将谈论生活细胞的光毒性。毫不奇怪,光源发射紫外线会对细胞造成破坏我们试图图像。因为我们都知道,我们去太阳没有太阳阻滞剂,我们会被晒伤。细胞也可以一种,不会灼伤,但高,精力充沛的光灼伤和我们需要避免这种情况在执行现场成像。

所以,有什么问题吗?有些问题是使用的过滤器和二向色镜不是完全有效地阻止UV-like波长。这无法阻止这些波长会导致破坏细胞壁,细胞膜和将导致快速的细胞死亡。这样的问题的解决方案包括使用紫外线过滤减少紫外线辐射的影响,较短的曝光时间,和平衡的氧化还原环境。用激光消除宽视野将选择性照射样品只有所需的,选择波长线。,重要的是,使用的波长更精力充沛。如果可能的话,使用近红外波长。它将避免紫外线。在光谱的另一端。

近红外波长更长的波长和少精力充沛。这是更好的细胞,更健康,它还提供了允许更多更深的优势渗透到样品。和大多数的分子导致自体荧光对近红外波长不发出荧光。这实际上开始是一个很好的赌注开始使用这个波长。最近,已经有一些荧光蛋白和荧光染料化学染料,可以使用使用近红外波长。,重要的是,如果你在选择,选择一个活体成像实验系统兼容。这样的系统可能之一,例如,一个双显微镜头旋转的磁盘系统。

现在,讨论安装和设计。当你设置和设计一个实验,需要考虑我研究所显微镜做什么?这些显微镜过滤集做什么?而且,不…不要忘记,就像我之前提到的,目标是什么?可用的激光线是什么?和非常重要的,我想做什么?所以,我想做什么?我想图像活样本或一个固定的样本吗?我想执行一个多色实验或一个颜色?

做这样的实验,我要如何染色吗?我将用荧光抗体,荧光蛋白质,或量子点。我要用什么呢?我需要选择适当的荧光染料或荧光蛋白能够被我要用的设备。我需要设计样品制备协议。和非常重要的,有时忽视,在显微镜下,设计成像收购协议。我想收购我的图像吗?

总之,在这个演讲,我走你通过荧光是如何工作的,什么是所需的硬件EP荧光显微镜,荧光显微镜的警告,和事情需要考虑建立和设计一个荧光实验。现在,我只需要感谢大家听这个演讲。我可以邀请你来跟进我们学校和或显微镜系列。下一个新闻,你有课程共焦显微镜,免疫组织化学样品制备。非常感谢你的倾听,我希望你可以加入本课程的进一步类。