光谱流式细胞术

固有的流式细胞分析仪的设计给出了一个独特的优点在多参数测量单个粒子,其中每个fluorphore匹配是一个独特的探测器。然而,收集完整的长期目标发射光谱的幽灵似地标记粒子仍然难以捉摸。近年来教授约翰·诺兰拉霍亚生物工程研究所的教授和他的团队取得了显著的进展在圣地亚哥朝着这一目标通过高通量耦合色散光谱仪标准设计流程血细胞计数器。

介绍

诺兰集团已开发出一种光谱流式细胞分析仪(证监会)能够获得完整的单一粒子的发射光谱色散光学分光计替代,代替传统的镜子,过滤器和光电倍增管(pmt)传统流式细胞分析仪。香港证监会的一个关键组件是一个高速度、多CCD探测器,使一个完整的集合高分辨率光谱在单个细胞的运输时间短通过仪器探头体积。测量是提高传统流血细胞计数器通过这些探测器的灵敏度高,尤其是在近红外光谱区,并通过允许信号增强的片上装箱能力,同时减少噪音。高度敏感的耦合探测器具有高吞吐量成像光谱仪测量时间允许接近每秒200事件。

设置

诺兰集团的第一代证监会特色能够区分粒子的收集和检测系统使用表面增强拉曼光谱(ser)。[1]拉曼光谱非常适合多参数测量的可用性在一个相对较小的光谱窗口窄的光谱特性。拉曼仪器流式细胞术已被证明能够描述的拉曼活性人口大部分纳米制剂在单个纳米水平。[2]这使得优化的ser标记的纳米粒子合成生产散装制剂的大部分纳米粒子具有很高的拉曼活性。最近,该系统已被用于区分种群的细胞标记和两个不同的ser标记抗体。[3]的喇曼光谱流式细胞分析仪非常适合解决的许多常见的应用于流式细胞术,但是荧光标记通常用作标记的代理。因此一个系统能够区分相对广泛的可见光和近红外发射探头发射是必要的。

为此,诺兰集团已经开发了两个第二代香港证监会(图1)。[4]的第一个配置可见荧光检测和基于光具座从商用流式细胞分析仪(FACSCanto BD生物科学)。激发通过488 nm和405 nm激光定向流动细胞流式细胞分析仪的光束控制和塑造光学。光谱检测系统由光纤耦合HoloSpec成像光谱仪与457 nm边缘滤波器或488海里陷波滤波器和宽带体积相位全息光栅耦合到一个牛顿DU970-UVB EMCCD探测器。第二个系统类似于前文所述的喇曼流式细胞分析仪[1],但配置为近红外荧光,并使用785纳米二极管激光器激发。发出的光光纤耦合HoloSpec成像光谱仪785海里边缘滤波器和窄带体积相位全息光栅使用牛顿DU920NBRDD检测。在两个系统光谱检测触发使用了光散射角(歧视)各自的光学试验台的检测系统。

使用一个基于色散光学、高吞吐量摄谱仪用高灵敏度的CCD探测器提供了增加多路复用功能与传统流血细胞计数器。但是,为了实现数据的利益增加到多细胞和粒子的基础应用,光谱分离数据分析程序是必需的。诺兰组两种光谱分离的方法应用于荧光光谱数据流式细胞术。第一个复制传统流式细胞分析仪谱分离的光学过滤器。数字滤波器应用在收购后分析以单独的总信号的不同光谱组件。这提供了一个巨大的优势在传统方法由于过滤器的数量是有限的,只有光谱数据点的数量和每个过滤器可以调到精确匹配的发射光谱荧光染料。即便如此,这个滤光片分析的力量是有限的,由于广泛的光谱特性典型的荧光染料确保大量的相声相邻过滤器染料与类似的发射光谱。第二种方法使用一个自定义的非负古典最小二乘(CLS)例程。这种方法假定荧光染料的检测信号从混合组件的单个光谱的线性组合。使用这种方法,光谱分离可以清楚地识别荧光标记即使高度的光谱重叠。

结果与讨论

图2:单一的平均光谱珠子沾Qdots: QD525, QD565, QD585, QD605 QD655, QD705。平均荧光强度是归一化平均每个Qdot峰值强度。

为了描述的能力证监会与荧光标签区分粒子,诺兰团队测量微球标记的六种不同的量子点使用仪器优化检测,可见(图2)。使用自定义CLS的例程,光谱流式细胞分析仪不仅可以唯一地标识每个微球上的标签但可以确定每个组件的数量。另外光谱混合的例程可以占的绝对亮度差异六种不同的标签,从而定量荧光标记抗体测量的基础。接下来,团队测量混合的二,三,四,五,六的量子点标记微球并成功地确定每个组件和所有5混合物的相对丰度。最后,该技术被应用到一个共同的流式细胞术的应用,分析PBMCs沾规范表面标记用于淋巴细胞构造子集。CLS不混溶的光谱流式细胞分析仪能够区分CD14 +单核细胞和CD3 + T细胞CD4和CD8阳性子集演示仪器功能在“真实世界”的应用程序。

图3:单一的平均光谱珠子沾以下近红外荧光团:Alexa 750年IRDye800, DyLight 800年Cy7.5,平均荧光强度归一化到每个Qdot的平均峰值强度。

传统的流与光谱检测血细胞计数器斗争红色和近红外光谱区域主要是由于PMT的,而表现不佳(量子效率= 2 - 8%)。使用黑色背景深耗尽(BRDD)探测器在色散光谱仪将允许香港证监会利用增加可用性的荧光染料的发射光谱窗口。为了在光谱探测近红外荧光的可能性应用流式细胞术,诺兰组七个不同的特征荧光标记微球与发射的近红外光谱。七染料测试,三(Alexa 750、Cy7.5和DyLight 830)给光谱有足够的区别与CLS分离允许独特的决心,(图3)。结果表明一个有前途的未来谱流式细胞术在近红外光谱区,与染料已经商业化。明亮的增加发展染料与红光对于缓解应该使用近红外发射光谱区域的流式细胞术应用在不久的将来。

引用

1. 华生,D.A.,布朗,润滑、Gaskill测向Naivar, M。坟墓,S.W.多尔恩,”栏目诺兰,摩根大通,流式细胞分析仪测量拉曼光谱,”血细胞计数的一部分,73卷,p119 - 128 (2008)
2. Sebba,科学博士沃森,D.A.诺兰,摩根大通高通量单纳米光谱学ACS Nano, 3号6 p卷,1477 - 1484,(2009)
3. 诺兰,摩根大通达根E。刘E。Condello D。戴夫,我。斯通内尔,S.A.单细胞分析使用表面增强喇曼散射(ser)标签,方法57卷,p272 - 279 (2012)
4. 诺兰,摩根大通Condello D。达根E。Naivar, M。新生,D。,可见光和近红外荧光光谱流式细胞术。血细胞计数部分卷。83年,3号,p253 - 264 (2013)