学校和或显微镜成像和传感器数字显微镜摄像头和传感器

你好。我的名字叫艾伦·马伦博士。和我是一个产品专家显微镜相机和或技术。在这个模块中,我们将看看显微镜相机。在高级别上来看,我们可以说我们有一些敏感的探测器,和我们能够探测到光光子的形式在我们的样例。这些可以通过样本或他们可能会从一个或多个荧光标签样本。探测器将光子和将电子数字化信号。信号将会非常低。它可以是一个订单的每像素甚至个位数的光子。所以它需要受到一个放大器,然后发送到PC的数据,然后在电脑上我们可以查看和分析这些数据在一个专门的软件包。

然后议程为这个模块是看数字成像技术和传感器技术的基本原理。因此我们将看看概述从相机的成像参数的角度来看,然后开始看显微镜相机本身,和相机的关键部分的概述。然后我们将开始调查更详细和传感器,所使用的相机技术。在以下模块,我们将看看我们比较这些相机技术,这些性能标准,我们已经讨论了在这个模块中,然后我们如何使用这些来匹配不同的应用程序。

开始在第1部分中,我们将看看概述图像参数从一个很高的水平,从相机的观点。让我们考虑什么样的图片,我们可能会试图用相机捕捉。所以我们可能有一系列不同的成像技术,这取决于我们看。brightfield, DIC,荧光,在这里,或者我们可以发光。规模,我们从试图看可以看整个有机体某种发展研究,看大片的组织在低的放大,和单个细胞,分解成单分子水平。

我们也有不同的时间尺度来考虑。我们可以观察细胞内动态过程和事件发生在一个小的毫秒数到事件发生在一个更长的持续时间。所以发展研究,考虑几个小时的几天。然后发光研究,我们可能需要捕获一个非常微弱的信号在更长一段时间的分钟。然后我们也要看看使用不同数量的或类型的格式。我们可以使用标准的幻灯片,或盘子,或者多板块,例如。

虽然会有各种不同类型的图像,我们可以看到使用多种不同的技术在不同的时间尺度,我们只是想在结构信息,或者你可能想量化的东西,我们都可以合理化分成若干主要成像参数。和主要的敏感性。只是我们能找到,我们可以想象我们感兴趣吗?的视野,我们需要看到多少的区域在任何一个时间吗?然后速度,是一个过程,需要很高的成像速度快,还是发生在更长一段时间吗?

还有许多次要标准,这也很重要,比如决议,决议我们需要多少钱我们看什么?动态范围,有一系列的低水平和高水平信号的形象吗?所以不同的应用程序会有偏向其中一个区域或一个区域可能不是特别重要。但是不同的相机技术和模型都有自己的优点和缺点。所以力量在一个领域可能导致的另一个弱点的。提高灵敏度的相机发展的主要驱动力之一。,很明显这是为什么,因为它是基础,我们可以检测我们感兴趣的信号,从他们那里得到一个很好的信噪比。

所以当我们谈论的信号噪声比,后来我们将分解到不同的元素参与信号和噪音的来源。所以对于低信号噪声代表在这里我们看到了一个高尔夫球,这是部分隐藏在草丛的声音,我们有一个非常小的信号和噪音之间的区别。因此很难辨别任何图像或图像中的任何细节,我们会。但是如果我们有一个很好的和高信号噪声,这使它非常容易看到的对象。所以任何图片,我们有高信号噪声比我们想要达到的目标。这是试图最大化信号和噪音最小化元素。三个部分中,我们将研究这些。

的视野,有时我们可能需要捕捉大区域。组织部分,例如,我们可能想好好看看,说,细胞组织学研究部分。我们看着非常低的放大。但我们也可能想看看一个胚胎的发展随着时间的推移,果蝇和斑马鱼等例子。然后我们也要开始看也许细胞膜甚至单分子衍射斑点在非常高的放大倍数有限。所以我们还需要考虑然后我们将摄像机的显微镜,所以相机需要能够挂载到显微镜端口然后也匹配的视野从物镜是可能的。

一般来说,一个更广泛的视野将意味着有更多的数据需要从镜头转移到控制电脑。它会花费我们更多的时间。有更多的信息需要花费很长的时间来传输这些信息。正如我们都知道,当我们增加放大,只是一般在显微镜,我们将减少的视野。每当我们谈论照相机和成像速度,这样他们就可以提供或他们需要做什么,这个问题有两个方面。第一个是过程的性质,我们想研究。非常动态的事件,如细胞信号,真正需要的窗口内的决议在某些情况下几毫秒。所以我们需要能够跑得很快。

但在大多数情况下,我们的处理在正常细胞生物学,我们不需要以这样的速度运行。但它总是一个好主意来运行风险尽可能低,持续时间也就击倒消除强度因为我们想减少对细胞的影响,我们正在研究。一些实验,当然,他们需要更长的时间收购。使用发光信号参与实验,是否这是一个动物的生物发光系统,或相当普遍,无论是在植物成像,这些类型的发光信号非常低。所以我们必须捕获少量的信号和积累和建立起来甚至多达5,10,甚至20分钟。有其他方面的考虑。

另一边,这就是简单的得到更多的数据更快。更快的相机将真正进入自己的如果我们有一个实验,我们有大型数据集。所以它可以筛选多井盘子。或者如果我们有一个大的样本,我们可以构建多个瓦片,看着ZED建立一个三维图像。这需要一些时间,更快的相机将帮助。当然,我们也有限与相机的更广泛的系统,我们已经与阶段等等,。相机速度通常是表示帧每秒。另外,有时我们看到10赫兹。所以10帧每秒会是100毫秒,曝光时间,相机将会耗尽。

相机也需要能够收集足够的信号在这曝光,让它运行在高速度。只是一个相机在技术上能够运行在非常高的帧速率每当涉及到现实世界中,我们需要记住,如果我们从100毫秒暴露在10毫秒曝光,将捕获的光子数量将相应减少。我们可以与多少信号是有限的我们而言,我们可以跑多快,照相机。和照相机和传感器,有很多我们可以做的事情。我们可以提高相机的速度被砍伐的区域感兴趣的一个更小的子区域传感器,这样我们可以更快地运行。或者我们可以用另一种方法,尤其是对CCD相机,叫做装箱,我们可以将一个像素合并到更大数量的像素,我们称之为一个超级像素,然后一些很多,这种输出,一个更大的像素相机更快地运行。但它会降低空间分辨率因为我们有效地从一个像素的大小和我们扩展到更大的尺寸。

的决议,那么,解决细节,好吧,我们需要能够解决图像信息,这样我们想要解决这个问题可以结构信息和想看看组件硝唑细胞膜或微管,为例。然后这个对比是很重要的决议,因为它更容易区分两个高对比度特性相比,两个低对比度特性。我们需要确保我们是匹配的分辨率显微镜本身的能力。奈奎斯特准则,为此,我们看看会议,确保我们足够抽样是通过摄像机的图像。

所以,相机,像素大小可能是我们要考虑的关键参数。当然,这些东西总有妥协。并与像素在这种情况下,较小的像素并不一定是一个优势。我们将讨论在以后更多的细节。对比度和分辨率可能结合成一个单一的规范等……被称为MTF,调制传递函数。有时这是提到,其他时候不是这样的。动态范围的区别是最低和最高的信号电平,可以形象。一个典型的图像可以有一系列的强度。和许多图片,我们将有低水平的信息对我们非常重要,还亮的区域。

在这些情况下,它是非常重要的,有一台相机的宽动态范围可以捕捉到这些信息。通常情况下,摄像机与低噪声和大深度值会有很宽的动态范围。他们有能力处理这些大的变化信号只要他们适当的配置。在这个例子中,我们可以看到,当我们没有足够的动态范围的图像,最后这种过饱和效应在这里我们可以看到它的刷爆了,我们要在这些地区没有有用的图像信息。然而,在这一领域,只要我们有一个足够宽动态范围,我们可以抓住这个低层次信息和现在这个高水平信息,我们也可以看到细节。

所以在我们进入相机本身的细节,让我们一个基本的概述现代显微镜相机。首先,我们已经在前面的相机相机显微镜的安装或其他光学设置。通常,我们将有一个C-mount。然后对一些较大的视场相机和显微镜配置22毫米以上,他们可以使用F-mount。此外,将会有一些其他的光学装置安装位置。这些都需要光紧密连接,以避免任何泄漏这些相机是如此敏感,任何杂散光往往可以拿起相机,我们可以看到,影响我们的形象。

所以可能还有一些额外的支架我们可以看到在摄像头。这让我们安全摄像机光学表。之间的一些相机可以在任何地方一到三公斤的体重。这样也避免了光学系统上的任何压力和避免任何问题与振动。有时会忽略的东西相机窗口。有一个窗口保护传感器从碎片和伤害。这是一个很重要的工作。系统的窗口是一个重要的光学元件,它需要能够传输波长的利益。所以常用的材料是石英或紫外线网格二氧化硅。

不同anti-reflection涂料可以应用到这款相机窗口优化传输特性。通常情况下,这并不是我们需要考虑当我们做标准类型的实验使用荧光团或宽视野显微镜。但每当我们开始工作以外的,可见光谱在紫外区域的蓝色或向上进入近红外,然后我们可以开始看其他涂料的相机窗口,否则我们将开始失去一些整个系统的效率。

此外,在这个空间安装板和相机之间的窗口,相机可能百叶窗。通常你会看到这些老CCD相机。所以对于许多现代显微镜摄像头,他们不会有一个快门,这真的是红灯照在收购之间的传感器。然后我们有传感器室。所以传感器在本质上是非常微妙的,稍后我们将介绍也减少噪声传感器可能会冷。那么在这种环境下,传感器本身发热和我们也有……所以我们有冷热元素。所以我们需要小心,以防止任何冷凝形成。这意味着传感器会需要某种形式的密封室没有任何水分。

有多种不同的方法来做这个。最常见的一种方法用相机是通过这一过程被称为回填。本质上这充满了干气。它可能是干燥空气或氮气,例如。然后一些中可能添加干燥剂吸收的任何访问或任何额外的水分。然后密封起来。另最后一列,理想的方法有感官室摄像机传感器是使用密封的真空室。这仅仅是真的发现更高性能的相机,因为它是相当艰难的过程从制造业的观点。但纤维(SP)系统允许传感器在密封室的环境中运作。

当传感器CCD或sCMOS,它是由硅胶,许多像素的一个数组。所以它可能是现代传感器1和4.2像素之间的可能。虽然很多低于我们知道从我们的消费相机,我们会对手机我们会进入之后,这些匹配与类型的显微镜的放大和字段的视图。传感器本身可能是颜色或mono的设计。再一次,我们将看到为什么您可能想要使用一个颜色相机或者为什么许多这样的高端相机往往是mono的设计。所以,他们不会颜色。像许多电气组件,传感器通过他们的操作会产生热量,热量需要消散。

在传感器的情况下,它需要消散,因为它会导致噪声影响测量。和速度传感器或传感器越大,会产生更多的热量。小,缓慢的传感器可能只是需要被动冷却。这是生成的热量是通过散热片。这可能包括生活环境调查相机本身,但更大的和高性能传感器需要主动冷却。这意味着你有一个热电冷却器连接到传感器组装,然后使用空气冷却用风扇来提取和消除热量,否则您可以使用水冷替代方法消除传感器的热量。

和水的冷却模型,它增加了一些额外的复杂性的系统,需要水冷却的设置。它还最大化潜在的任何振动。所以特别敏感的测量,水冷却将是一个选择考虑与他们的相机。现代照相机机载电子设备,有一系列不同的功能。这些包括诸如噪声校正。我们也有,特别是sCMOS相机,有修正或地图应用逐像素的基础上,以确保我们有一个统一的应对光在每个像素内的传感器。和科学相机控制通常由控制电脑和软件,那么相机与电脑和软件接口方案。

Connections-wise,相机将电源和信号电缆的数量。最基本的相机可能只需要使用一个USB线的一部分。和其他时候,每当我们有活跃的冷却,我们需要专用电源的相机。所以它需要很多的相机降温- 25,甚至,在某些情况下,对于iXon EMCCD相机,它实际上要零下100度c,尤其是现代传感器,我们需要能够支持高质量的数据流的相机,我们开始看到那么老的相机可能使用USB 2。这些已经被其他格式,比如CameraLink,最近CoaXPress, GigE,甚至后来版本的USB 3、4坐骑让相机在40、50岁,甚至100帧每秒和16位模式。这是大量的数据被转移。

本模块三部分,我们要开始看东西更详细一些。这是进入传感器和相机技术。所以这将看看CCD和sCMOS相机如何工作和一些常见的问题,提出了这些技术。然后在接下来的模块,然后我们将开始进入真正的细节和比较不同的相机,我们提到的性能参数,看看他们如何将不同的应用程序。

现代成像传感器通常基于CCD或sCMOS。这两种传感器类型已经存在了很长一段时间在1960年代末和逐步发展,随着时间的推移我们会讲到。CCD代表电荷耦合装置。稍后我们还将看到EMCCD,添加了一个电子倍增。然后基于CMOS技术的相机,互补金属氧化物半导体。的变化,我们正在谈论sCMOS显微镜应用程序,即科学CMOS。正如我们前面所提到的,传感器的作用是将光子转换成可用的电子信号。让我们继续看看这究竟是如何发生的。

多光子转换成电子信号在每个像素可以概括如下。偏置电压在这些门的每个像素电极,以便创建一个枯竭的地区在硅胶。在这个废弃的地区,如果入射光子有足够的能量,他们将释放一个电子,这随后能被探测到的电荷。以及电子本身可以通过传感器传输通过应用精确定时时钟电压。这个过程称为量子效率和效率表示为一个百分比。百分之五十的量化宽松政策将意味着一半的输入信号将被转换成一个电子。

波长较短的蓝色和紫外区域,他们倾向于吸收失败所以他们没有达到这个感光中心地区和高百分比。所以你会看到一个减少量化宽松政策通常在蓝色区域。在红色区域,这些更长的波长可能完全穿过废弃的地区。所以,可以有一个下降的量化宽松政策。你通常会看到一个量化宽松政策响应峰值在可见范围内。波长在1.1微米左右,没有足够的能量来产生电子在硅酮。所以你要看看其他类型的探测器技术开始研究这些更高的波长。

正在使用的条款你会听到一个相当定期对传感器是照明传感器和前照明传感器。所以这是什么意思?正如我们前面看到的,每一个像素的感光元素。它需要有很多额外的元素的一部分。有结构和各种线路,它允许电压被应用到像素允许这种转换发生。它还需要进行像素的电子信息。从生产的角度来看,前面照明传感器这上面放置传感器的感光面积。虽然很好生产,显然,这是不会很好的捕捉我们想要测量的信号。信号通过电路或网络,我们叫它。

所以有些传入信号的通过,这些结构阻碍传入的信号。这将减少我们的量子效率和信号转换成电子信号我们可以以后再处理。后面的发光传感器设计,它解决了这个问题。正如你所看到的,所发生的是,我们已经基本上翻传感器上下颠倒。但是有一个更比一个制造业的观点。所以我们要做的就是必须鳍或腐蚀这多余的硅衬底。所以这就是为什么有时这些照明传感器被称为背翅片sCMOS或设备。现在这意味着传感器可以获取高转化率的光子成电子,我们已经删除了这些障碍。

现在最新的型号可以达到的效率约为95%,而前面的照明设计,我们期望他们会约60%左右。但是如果我们使用微透镜和其他策略,这是相当惊人的,这些设备能够分成80%的效率。但是回到照明传感器,所以,这是伟大的。我们最大化光子转换成电子。但这个过程的缺点是,当然,它会花费更多当我们添加了额外的制造过程。也就会减少产量的传感器。所以有点价格溢价支付这些类型的设计。

简要讨论的另一个重要的事情是关于颜色或单一传感器的使用。通常情况下,如果我们考虑标准的低成本相机可能会提供一个显微镜,它可能是一个颜色的相机。当我们开始做更有挑战性的工作,不要去掉相机,然后我们发现相机我们要换成是一个潜在的mono相机。这不会立即产生一种颜色信号。为什么这是与灵敏度。彩色相机不会这些mono相机一样敏感。但是他们会适合当样本相对明亮。他们并不敏感,因为有特定的红、绿、蓝像素只会回应光频谱的一个特定的范围内。

然后,也意味着将会有更少的机会一个像素的特定光子撞击。他们需要被放置在一个数组在传感器模式。这意味着,我们不会得到尽可能好的灵敏度,在传感器设计中每一个像素内它是敏感光在更大范围的一部分。但话虽这么说,颜色相机是很灵活的。和相当多的工作,他们可能非常有用。一些brightfield放大倍数较低的工作,我们可以看到一系列的样品和我们想用相机只是一些基本的信息。

现代mono相机另一方面像素,以非常高的效率应对光在更广泛的范围。他们将要在频谱进行了优化。这将覆盖大部分将使用典型的荧光染料和蛋白质。所以无论是DAPI GFP,或任何的Alexa萤石染料。然后我们如何生成彩色图像从激发发射是我们使用过滤器来捕捉信息,感兴趣的是特定的波长荧光团。然后我们使用软件规模的信号强度检测到一个颜色通道。当然,我们不必被限制在你选择一个蓝色代表一个特定的荧光蛋白。我们可以有效地上色这些来满足我们的需求,我们努力只是标签结构内部的利益。

现在我们开始看看噪音的来源,因为他们要参与不同的传感器。获得良好形象,我们要确保我们得到最好的信号和最小化任何噪音的来源。所以之前认为的传感器、噪声本身有自己的与之相关的固有噪声称为光子散粒噪声。这是与自然的光和信号的不确定性,所以,如果我们监测信号,将上下波动。那么信号噪声比,我们来看看,我们有一个有用的信号信息,我们可以做些什么。然后我们有我们想要的其他背景噪音降到最低。

相机,这可以翻译成这个方程简化版本由以下关系有信号,即量子效率在发出的波长或冲击传感器,乘以轰击的光子数。然后我们有参与的噪声源相机本身。所以暗电流噪声生成的硅传感器本身。称为暗电流,因为它存在时没有信号应用于传感器。规模或将随着投资增加。所以暗电流乘以曝光时间的平方,你在这里看到的。然后读噪音产生的噪声传感器读出过程的结果。

相机的技术我们要看看不久,EMCCD,它有一个额外的噪声系数,这是由于独特的过程。但我们会专门讨论这个当我们谈论EMCCDs。正如我提到的,也有相关的噪声光本身。现在让我们工作通过不同类型的传感器,可在这些常见类型的相机。开始与CCD。电荷耦合装置已经在各种形式自1960年代末。现在,当然,他们会很好地理解和设计优化/实现高成像性能。

有很多的设计出现了。但在这些设计,通常有一个放大器和一个角落,从每个像素是按顺序传输一个晚上在一个串行的过程,作为输出的放大器。所以CCD传感器操作在一个连续的过程。第一个CCD的设计被称为全帧CCD。这些都是最基本的设计。本质上有一个图像区域每个像素和电荷转移到下一个使用一系列的电压,通过这些死亡列,然后它是横向转移。注意这些重要组成部分是在成像方面,重要的是,光不继续下跌在传感器读出或每当电荷被转移,否则将生成新的电子在这些像素,你会得到一个图像镜像效应。

对于其中的一些设备,你需要使用一个快门来避免这种情况。这意味着,那些配置和设备要慢。这是全帧ccd的限制。帧转移CCD是一种CCD,一定程度上尝试解决一些速度和图像反映的问题,我们会有一个完整的框架。所以还有一个硅胶,蒙面的光,用于传输的电子成像面积分成这蒙面。所以,当发生这种情况,又可以获得信号通过传感器的成像区域。这允许传感器运行更快,加快整个过程的传感器。

所以真的有两个缺点,你已经翻倍了你因为你有复制的硅胶量成像区域这掩盖了地区所以这将是更加昂贵。也是,因为它不是我们能够瞬时转移所有的信息在这完整的传感器对分解成蒙面面积,还可以有少量的拖尾是可能的。另一种尝试和进步与铁路联运CCD CCD传感器设备。我们试着做的这些是我们有一个额外的列放置在成像区域。再说一遍,这是一个蒙面的区域或一列像素。这时间,这允许您做的是它允许您将电荷迅速从成像像素到蒙面的区域,然后转移信息通过列掩盖了地区。这真的可以让你加快传感器。也因为你只是转移在一个像素,它能避免其他问题的设计与图像镜像效果。

当然,这样的事情总有缺点。自从我们推出这一系列额外的掩盖了列传感器,我们降低了光收集这方面的能力。这是叫做填充因子。所以能做些什么来改善这种填充因数,并确保我们得到的所有光子会降落在传感器领域是通过使用微透镜,因此微透镜,并将延伸过去成像像素,让它填满空间。这些工作很好显微镜,因为通常情况下,入射光有效光线平行,因此任何光通过微透镜成像区域和最终的感光面积硅胶。对于其他应用程序,使用微透镜可能不是那么好,因为一旦你的光在一个轴,那么你往往不能够收敛光所需的区域,你可以得到像素之间的相声和其他各种降低效率的影响。

虽然铁路联运CCD很大程度上取代了最新sCMOS相机,和普通CCD版本的相机真的是局限于发光和不再接触应用,一种类型的CCD相机,仍然非常相关,EMCCD相机。这是因为他们有独家额外的芯片上的函数或过程,他们可以利用。这使它们特别适合最具挑战性的成像应用,如单分子研究。他们有这些额外的电子倍增寄存器,除非他们有…他们利用高电压利用这一过程称为碰撞电离。并通过注册并通过移动应用这些电压,它能够产生更多的电子比你开始。这些将积累和建立在整个注册。

,使我们能够提高信号歧管之前我们读出信号的传感器。所以你可能只有一个非常小的光子数,两个,三个,四个,甚至一个光子,例如,你仍然可以得到一个有用的信号从一个EMCCD相机通过这种方式。有时人们可能说EMCCD有效零噪音或不到一个电子阅读的噪音。这并不完全正确。相机的噪声地板仍然存在。你做了什么,当你否定读噪声地板有效地通过提高信号多次,说,500倍。所以每当你读出来的信号,这是这么多多余的背景噪音。所以EMCCD相机相机的技术仍然相关。

用CCD传感器,我们看到,他们已经存在了很长一段时间。在这的时间长度,增量的改进技术发生或发生,这样他们可以提取更多的速度和提高性能的传感器。然而,本质上他们是有限的串行特性读出这些传感器的过程。所以在比EMMCD, CCD摄像机通常被sCMOS技术所取代。互补金属氧化物半导体,回到这个开始,CMOS传感器也已经存在了很长时间。这不是一项新技术。但在这些传感器像素放大器,这使他们能够执行一些步骤,CCD将一直试图路线都通过一个共同的途径。

所以,这意味着可以更快的读出。但CMOS传感器的早些时候,你就会看到他们在摄像机和其他消费者和低成本的设备。因此,他们并不是真正的图像质量接近水平,你可以得到相当于科学CCD传感器。但是,尽管如此,高速度,低噪声方面的传感器是被视为这些可能有利于科学应用程序。识别潜在的CMOS科学成像应用中,有一个共同合作的一个传感器制造商,E2V仙童成像,和也的两个相机制造商PCO和和或技术。

这是现在的结果被称为科学的CMOS,简称sCMOS。介绍这些sCMOS相机,这些相机的好处在铁路联运CCD相机当时非常清晰和前进的一大步,不仅显微镜成像方面,但对于更广泛的应用。所以第一个设计被称为Andor Neo,大约在2009年,2010年被释放。现在这种技术已经存在和精制永远了10年。sCMOS和他们所能提供的好处是,你可以有大传感器尺寸和高速度和低噪声。这给了你很好的属性显微镜。此外,他们还让你有高分辨率和让你有良好的动态范围。正如我所说,这些都是如此成功,或者这个公式非常成功,Neo, Zyla和其他相机基于sCMOS很快取代了铁路联运CCD相机在作为最常见的探测器类型。

我们看到的一些基本方面数字显微镜成像显微镜相机。显微镜相机有一个从我们的形象和角色收集光子转换成可用的电子数字化信号。和一些重要的方面在考虑相机是他们的敏感性,他们的视野,他们的成像速度的能力。还有其他的次要方面,我们必须考虑,例如,他们能解决的图像信息通过显微镜吗?和他们有必要的动态范围的样品我们正在处理吗?试图满足这些需求,已经有了许多不同的技术,如CCD和CMOS更重要的是,解决这些成像要求。多年来,这些都是礼物,他们继续完善和更新。

在接下来的模块,我们要开始比较关键的相机感兴趣的。这是CCD、EMCCD sCMOS。所以我们要做的是我们希望匹配他们支持对这些原始标准的敏感性,视野,和速度,看看他们怎么相对比较。然后我们可以看看如何与不同的相机技术对不同的应用程序的特定需求,是否这是钙成像的东西非常快,某种叫做焦成像实验,是否这是盯着发光的研究在较长一段时间。