克服不正确的染色体分裂细胞梭形纤维附件

图1所示。三个选择静态图像的电影POLO-depleted细胞明显表明,随着时间的推移,强烈的着丝粒/动粒信号(红色)解析成一对点,这表明染色体syntelically纺锤体微管(绿色)。4 d荧光显微镜数据集收集每30秒和0.5毫米z-steps覆盖整个细胞体积使用100°,1.4 NA plan-apochromatic客观25°C和或革命的共焦单元和旋转的圆盘iXon EMCCD相机,都由和或智商live-cell成像软件。

细胞有丝分裂细胞分裂所依赖的能力妥善分配姐妹染色单体成形成细胞。可靠地执行功能细胞使用内部编辑机制来纠正不准确的染色体/梭形纤维附件。双着丝粒通常正确连接轴对齐纤维和隔离染色质,然而,错误和不当的着丝粒的结果。细胞包含专业编辑机制,预防和纠正这些偏差对着丝粒,但确切的机制还不是很清楚,2。提出了塔蒂阿娜Moutinho-Santos大学波尔图,葡萄牙皇家研究院Biologia分子e Celular (IBMC)马球激酶的存在是必要的,以促进染色体bi-orientation(称为amphitelic安排),从而保持适当的着丝粒对齐。

为了更好地理解它的作用在调节着丝粒发展,穆迪尼奥多斯桑托斯博士研究了贫果蝇马球活细胞内激酶证实马球参与维护所需的编辑功能amphitelic动粒安排。在这种情况下,syntelic安排(妹妹附加动粒微管来自相同的轴)进行了研究。间隔拍摄的有丝分裂进行分析果蝇S2细胞稳定表达CID-mCherry着丝粒的可视化和GFP-a-tubulin微管。着丝粒的可视化要求因其体积小、低荧光信号和细胞分裂期间短暂露面。共焦荧光显微镜通常用于图像动粒,然而,即使在这样的环境下,可视化仍然困难。着丝粒非常小(300海里)3,靠近外侧解决光学显微镜的功能,和超过显微镜的轴向解决能力。此外,在活细胞成像荧光标记构成潜在的光毒性的,光漂白的影响。强烈的激光照明可以创造光毒性问题,特别是破坏生活,细胞分裂。

和或革命XD旋转磁盘共焦显微镜是用来克服穆迪尼奥博士dos圣独特的挑战与着丝粒的观察。在这种情况下,四个独立因素必须同时解决充分可视化动态细胞过程:

• 收购的速度
• 时空分辨能力
• 检测荧光强度非常低水平的能力
• 管理可用的荧光信号

这些主题的空间、时间和强度解决频繁发作与荧光显微镜和经常与实验中观察细胞的可行性。例如,照相机的长时间曝光和长时间的高强度照明产生的光毒性的影响,活细胞损伤或破坏。同时,轻轻贴上微观结构可视化,但需求长时间的曝光可以被光漂白造成不利影响。更加复杂的问题是需要把传统三维数据的时间。最后,它仍然需要辨别信号从背景噪音和无所不能的阴霾。

的速度收购Mountinho多斯桑托斯博士是特别重要的。控制S2细胞分裂周期约为30分钟。然而,马球耗尽S2细胞利用在她的实验显示逮捕时间超过八小时。记录马球耗尽细胞分裂需要收集的7200年和12000年之间图像集(两种荧光染料成像每三十秒一到五小时,获得了0.5微米轴轴向动粒步骤高达20步骤分辨率)。传统荧光显微镜和激光照明将允许必要的柔和的照明需求和收购的速度来完成这时间敏感的任务。例如激光光栅在传统共焦显微镜需要更久的时间来收集信号的样本。旋转磁盘共焦系统用于克服这些传统障碍和揭示分子动粒编辑技术的新见解。

与传统的宽视野荧光系统相比,一个旋转的磁盘的空间分辨率共焦优越横向(x, y)和轴向(z)维度。通过不断扫描针孔阵列,可以实时查看样本在高对比度,提供清晰的图片在显微镜的光学衍射极限。这使得3 d可视化和动态动粒的理解行为与纺锤体的微管。着丝点,着丝粒的横向分辨率300 nm和梭形纤维300 - 500纳米的分辨率被报道,详细的图。

强度的决议
可视化荧光标记着丝粒与每一个着丝点额外增加了采集系统的要求。着丝粒,着丝粒研究主要是可见的只有在细胞分裂间期。细胞通过前期,着丝粒已经解决自己变成果蝇的典型12染色体配对。预算管理可用的光在冗长的收购需要柔和的照明和高分辨率能够通过旋转磁盘技术。光阑在旋转磁盘单元提供这些好处。因为光激发荧光团只有一个孔,光毒性的影响最小化。虽然有悖常理,降低光预算并不意味着微弱,难以探测对象。强度决议增加通过旋转磁盘的排除EMCCD相机聚焦信号和后续信号放大的架构。这将创建新的可能产生更高的对比度图像揭示了着丝粒等开发和点状的对象的对齐。

结论
使用旋转磁盘技术博士Mountinho多斯桑托斯活细胞应用导致一个重要的观察。没有马球的激酶,果蝇细胞被证明缺乏必要的纠正机制维持amphitelic染色体安排。马球的存在被证明为正确的着丝粒的架构,提供合适的环境,同时确保适当的染色体bi-orientation。培养果蝇细胞进行有丝分裂染色体没有马球激酶附加与syntelic梭形纤维取向,即。,附带姐姐动粒微管,来自一个单轴杆。

这个结论是通过仔细分析4 d荧光显微镜在细胞表达荧光标记着丝粒/动粒标记和微管。(图1)。